El ADN fetal libre de células ( ADNcff ) es ADN fetal que circula libremente en la sangre materna . Se toman muestras de sangre materna mediante venopunción . El análisis de cffDNA es un método de diagnóstico prenatal no invasivo que se solicita con frecuencia a mujeres embarazadas en edad materna avanzada . Dos horas después del parto, el cffDNA ya no es detectable en la sangre materna.
Fondo
El cffDNA se origina a partir de trofoblastos placentarios . [1] [2] El ADN fetal se fragmenta cuando las micropartículas placentarias se vierten en la circulación sanguínea materna . [3]
Los fragmentos de cffDNA tienen aproximadamente 200 pares de bases (pb) de longitud. Son significativamente más pequeños que los fragmentos de ADN materno. [4] La diferencia de tamaño permite distinguir el ADNcff de los fragmentos de ADN materno. [5] [6]
Aproximadamente del 11 al 13,4 por ciento del ADN libre de células en la sangre materna es de origen fetal. La cantidad varía mucho de una mujer embarazada a otra. [7] cffDNA está presente después de cinco a siete semanas de gestación. La cantidad de cffDNA aumenta a medida que avanza el embarazo. [8] La cantidad de cffDNA en la sangre materna disminuye rápidamente después del parto. Dos horas después del parto, el cffDNA ya no es detectable en la sangre materna. [9]
El análisis de cffDNA puede proporcionar un diagnóstico más temprano de las condiciones fetales que las técnicas actuales. Como el cffDNA se encuentra en la sangre materna, el muestreo no conlleva ningún riesgo asociado de aborto espontáneo . [10] [11] [12] [13] [14] El análisis de cffDNA tiene los mismos problemas éticos y prácticos que otras técnicas como la amniocentesis y el muestreo de vellosidades coriónicas . [15]
Algunas desventajas del muestreo de cffDNA incluyen una baja concentración de cffDNA en la sangre materna; variación en la cantidad de cffDNA entre individuos; una alta concentración de ADN libre de células maternas en comparación con el ADNcff en la sangre materna. [dieciséis]
La nueva evidencia muestra que la tasa de falla de la prueba de ADNcff es más alta, la fracción fetal (proporción de ADN fetal versus ADN materno en la muestra de sangre materna) es más baja y el VPP para las trisomías 18, 13 y el SCA está disminuido en los embarazos de FIV en comparación con los concebidos espontáneamente. [17]
Métodos de laboratorio
Se han desarrollado varios métodos de laboratorio para la detección del ADN fetal libre de células en busca de defectos genéticos. Los principales son (1) secuenciación de escopeta masivamente paralela (MPSS), (2) secuenciación masiva paralela dirigida (t-MPS) y (3) enfoque basado en polimorfismo de nucleótido único (SNP). [18] [19] [20]
Se toma una muestra de sangre periférica materna por venesección aproximadamente a las diez semanas de gestación. [21]
Separación de cffDNA
El plasma sanguíneo se separa de la muestra de sangre materna utilizando una centrífuga de laboratorio . A continuación, el cffDNA se aísla y se purifica. [22] Se redactó un protocolo estandarizado para hacer esto mediante una evaluación de la literatura científica . El mayor rendimiento en la extracción de cffDNA se obtuvo con el "QIAamp DSP Virus Kit". [23]
La adición de formaldehído a las muestras de sangre materna aumenta el rendimiento de cffDNA. El formaldehído estabiliza las células intactas y, por lo tanto, inhibe la liberación adicional de ADN materno. Con la adición de formaldehído, el porcentaje de cffDNA recuperado de una muestra de sangre materna varía entre 0.32 por ciento y 40 por ciento con una media de 7.7 por ciento. [24] Sin la adición de formaldehído, el porcentaje medio de cffDNA recuperado se ha medido en 20,2 por ciento. Sin embargo, otras cifras varían entre el 5 y el 96 por ciento. [25] [26]
La recuperación de cffDNA puede estar relacionada con la longitud de los fragmentos de DNA. Otra forma de aumentar el ADN fetal se basa en la longitud física de los fragmentos de ADN. Los fragmentos más pequeños pueden representar hasta el setenta por ciento del total de ADN libre de células en la muestra de sangre materna.
Análisis de cffDNA
En la PCR en tiempo real, se utilizan sondas fluorescentes para controlar la acumulación de amplicones . La señal fluorescente indicadora es proporcional al número de amplicones generados. El protocolo de PCR en tiempo real más apropiado se diseña de acuerdo con la mutación o genotipo particular a detectar. Las mutaciones puntuales se analizan con PCR cualitativa en tiempo real con el uso de sondas específicas de alelos . las inserciones y deleciones se analizan mediante mediciones de dosis utilizando PCR cuantitativa en tiempo real.
El ADNcff puede detectarse al encontrar secuencias de ADN heredadas por el padre mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [27] [28]
PCR cuantitativa en tiempo real
El gen Y de la región determinante del sexo (SRY) y la repetición en tándem corta del cromosoma Y "DYS14" en cffDNA de 511 embarazos se analizaron usando PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). En 401 de 403 embarazos en los que se extrajo sangre materna a las siete semanas de gestación o más, se encontraron ambos segmentos de ADN. [29]
PCR anidado
Se evaluó el uso de la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR anidada) para determinar el sexo mediante la detección de una señal específica del cromosoma Y en el ADNcff del plasma materno. La PCR anidada detectó 53 de 55 fetos masculinos. El cffDNA del plasma de 3 de 25 mujeres con fetos femeninos contenía la señal específica del cromosoma Y. La sensibilidad de la PCR anidada en este experimento fue del 96 por ciento. La especificidad fue del 88 por ciento. [30]
PCR digital
Los dispositivos de microfluidos permiten la cuantificación de segmentos de ADNcff en el plasma materno con una precisión superior a la de la PCR en tiempo real. Las mutaciones puntuales , la pérdida de heterocigosidad y la aneuploidía se pueden detectar en un solo paso de PCR. [31] [32] [33] La PCR digital puede diferenciar entre el plasma sanguíneo materno y el ADN fetal de forma múltiple . [31]
Secuencia de escopeta
La secuenciación rápida de alto rendimiento con herramientas como Solexa o Illumina produce aproximadamente 5 millones de etiquetas de secuencia por muestra de suero materno. Los embarazos aneuploides, como la trisomía, se identificaron al realizar la prueba en la decimocuarta semana de gestación. El mapeo del genoma completo fetal mediante análisis de haplotipos parentales se completó utilizando la secuenciación de cffDNA del suero materno. [13] Las mujeres embarazadas se estudiaron utilizando una secuenciación de ADN de plasma materno masivamente paralelo de 2 plex y la trisomía se diagnosticó con una puntuación z mayor a 3. [34] La secuenciación dio una sensibilidad del 100 por ciento, una especificidad del 97,9 por ciento, un valor predictivo positivo del 96,6 por ciento y un valor predictivo negativo del 100 por ciento.
Espectrometría de masas
Desorción / ionización láser asistida por matriz : espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) combinada con extensión de base única después de la PCR permite la detección de cffDNA con especificidad de base única y sensibilidad de molécula de ADN única. [35] El ADN se amplifica mediante PCR. Luego, se diseña la amplificación lineal con reacción de extensión de base (con un tercer cebador) para hibridar con la región corriente arriba del sitio de mutación . Se añaden una o dos bases al cebador de extensión para producir dos productos de extensión a partir de ADN de tipo salvaje y ADN mutante. La especificidad de una sola base proporciona ventajas sobre las técnicas basadas en hibridación que utilizan sondas de hidrólisis TaqMan . Al evaluar la técnica, no se encontraron falsos positivos ni negativos al buscar cffDNA para determinar el sexo fetal en dieciséis muestras de plasma materno. [35] El sexo de noventa y un fetos masculinos se detectó correctamente mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. La técnica tuvo una precisión, sensibilidad y especificidad de más del 99 por ciento. [36]
Modificaciones epigenéticas
Se pueden aprovechar las diferencias en la activación de genes entre el ADN materno y fetal. Las modificaciones epigenéticas ( modificaciones hereditarias que cambian la función de los genes sin cambiar la secuencia del ADN) pueden usarse para detectar cffDNA. [37] [38] El promotor RASSF1 A hipermetilado es un marcador fetal universal que se utiliza para confirmar la presencia de cffDNA. [39] Se describió una técnica en la que el cffDNA se extraía del plasma materno y luego se digirió con enzimas de restricción sensibles e insensibles a la metilación . Luego, se realizó el análisis de PCR en tiempo real de RASSF1A, SRY y DYS14. [39] El procedimiento detectó 79 de 90 (88 por ciento) muestras de sangre materna donde estaba presente RASSF1A hipermetilado.
ARNm
Las transcripciones de ARNm de genes expresados en la placenta son detectables en el plasma materno. [40] En este procedimiento, el plasma se centrifuga para que aparezca una capa acuosa. Esta capa se transfiere y de ella se extrae el ARN . La RT-PCR se usa para detectar una expresión seleccionada de ARN. Por ejemplo, el lactógeno placentario humano (hPL) y el ARNm de beta-hCG son estables en el plasma materno y pueden detectarse. (Ng et al. 2002). Esto puede ayudar a confirmar la presencia de cffDNA en el plasma materno. [dieciséis]
Aplicaciones
Discernimiento sexual prenatal
El análisis de cffDNA de una muestra de plasma materno permite el discernimiento prenatal del sexo . Las aplicaciones del discernimiento sexual prenatal incluyen:
- Pruebas de detección de enfermedades : si el sexo del feto es masculino o femenino permite determinar el riesgo de un trastorno genético recesivo ligado al cromosoma X en un embarazo en particular, especialmente cuando la madre es portadora genética del trastorno. [41]
- Preparación , para cualquier aspecto de la crianza que dependa del sexo.
- Selección del sexo , que después del diagnóstico genético previo al implante se puede realizar seleccionando solo embriones del sexo preferido o, después de los métodos posteriores al implante, mediante la realización de un aborto selectivo por sexo, según el resultado de la prueba y las preferencias personales.
En comparación con la ecografía obstétrica, que no es confiable para la determinación del sexo en el primer trimestre, y la amniocentesis, que conlleva un pequeño riesgo de aborto espontáneo , la toma de muestras de plasma materno para el análisis de cffDNA no presenta riesgos. [42] Los principales objetivos en el análisis de cffDNA son el gen responsable de la proteína de la región Y que determina el sexo (SRY) en el cromosoma Y y la secuencia DYS14. [43] [44]
Hiperplasia suprarrenal congénita
En la hiperplasia suprarrenal congénita , la corteza suprarrenal carece de una síntesis adecuada de corticosteroides, lo que genera un exceso de andrógenos suprarrenales y afecta a los fetos femeninos. [45] Existe una masculinización externa de los genitales en los fetos femeninos. [46] Las madres de fetos en riesgo reciben dexametasona a las 6 semanas de gestación para suprimir la liberación de andrógenos de la glándula pituitaria . [47]
Si el análisis de cffDNA obtenido de una muestra de plasma materno carece de marcadores genéticos que se encuentran solo en el cromosoma Y, es sugestivo de un feto femenino. Sin embargo, también podría indicar una falla del análisis en sí (un resultado falso negativo). Paternal polimorfismos genéticos y marcadores sexo independientes pueden ser utilizados para detectar cffDNA. Para esta aplicación debe estar presente un alto grado de heterocigosidad de estos marcadores. [48]
Prueba de paternidad
Las pruebas de paternidad de ADN prenatal están disponibles comercialmente. La prueba se puede realizar a las nueve semanas de gestación. [ cita requerida ]
Trastornos de un solo gen
Los trastornos autosómicos dominantes y recesivos de un solo gen que se han diagnosticado prenatalmente mediante el análisis del ADN heredado por el padre incluyen fibrosis quística , beta talasemia , anemia de células falciformes , atrofia muscular espinal y distrofia miotónica . [27] [43] El diagnóstico prenatal de trastornos de un solo gen que se deben a una mutación autosómica recesiva, una mutación autosómica dominante heredada de la madre o mutaciones de secuencia grande que incluyen duplicación, expansión o inserción de secuencias de ADN es más difícil. [49]
En el cffDNA, los fragmentos de 200 a 300 pb de longitud implicados en trastornos de un solo gen son más difíciles de detectar.
Por ejemplo, la condición autosómica dominante, la acondroplasia , es causada por la mutación puntual del gen FGFR3. [50] En dos embarazos con un feto con acondroplasia se encontró una mutación G1138A heredada paternamente del cffDNA de una muestra de plasma materno en uno y una mutación de novo G1138A del otro. [50]
En estudios de la genética de la corea de Huntington utilizando qRT-PCR de cffDNA de muestras de plasma materno, se han detectado repeticiones de CAG en niveles normales (17, 20 y 24). [51]
El cffDNA también puede usarse para diagnosticar trastornos de un solo gen . [15] Los avances en los procesos de laboratorio que utilizan cffDNA pueden permitir el diagnóstico prenatal de aneuploidías como la trisomía 21 (síndrome de Down) en el feto. [52] [32]
Enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido
La incompatibilidad de los antígenos RhD maternos y fetales es la principal causa de enfermedad hemolítica del recién nacido . [53] Aproximadamente el 15 por ciento de las mujeres caucásicas , del 3 al 5 por ciento de las mujeres negras de África y menos del 3 por ciento de las mujeres asiáticas tienen RhD negativo. [54]
El diagnóstico prenatal preciso es importante porque la enfermedad puede ser fatal para el recién nacido y porque el tratamiento que incluye inmunoglobulina intramuscular (Anti-D) o inmunoglobulina intravenosa puede administrarse a madres en riesgo. [55]
PCR para detectar RHD (genes) de genes exones 5 y 7 de cffDNA obtenido a partir de plasma materno entre 9 y 13 semanas de gestación da un alto grado de especificidad, sensibilidad y precisión de diagnóstico (> 90 por ciento) en comparación con la determinación RhD desde recién nacidos sangre del cordón suero . [53] Se obtuvieron resultados similares dirigidos a los exones 7 y 10. [56] La PCR digital en gotas en la determinación de RhD fetal fue comparable a una técnica de PCR en tiempo real de rutina. [57]
La determinación de rutina del estado de RhD fetal a partir del cffDNA en el suero materno permite el manejo temprano de embarazos de riesgo mientras reduce el uso innecesario de Anti-D en más del 25 por ciento. [58]
Aneuploidía
- Cromosomas sexuales
Análisis de suero materno cffDNA por secuenciación de alto rendimiento puede detectar cromosomas sexuales fetales comunes aneuploidías tales como el síndrome de Turner , el síndrome de Klinefelter y el triple X síndrome pero el procedimiento de valor predictivo positivo es bajo. [59]
- Trisomía 21
La trisomía fetal del cromosoma 21 es la causa del síndrome de Down. Esta trisomía puede detectarse mediante el análisis de cffDNA de sangre materna mediante secuenciación de escopeta masivamente paralela (MPSS). [60] Otra técnica es el análisis digital de regiones seleccionadas (DANSR). [60] Estas pruebas muestran una sensibilidad de aproximadamente el 99% y una especificidad de más del 99,9%. Por lo tanto, no pueden considerarse procedimientos de diagnóstico, pero pueden usarse para confirmar una prueba de detección materna positiva, como una prueba de detección del primer trimestre o marcadores ecográficos de la afección. [60] [61]
- Trisomía 13 y 18
Es posible el análisis del ADNcff del plasma materno con MPSS en busca de trisomía 13 o 18 [62]
Los factores que limitan la sensibilidad y la especificidad incluyen los niveles de cffDNA en el plasma materno; los cromosomas maternos pueden tener mosaicismo . [63]
Se pueden detectar varias moléculas de ácido nucleico fetal derivadas de cromosomas aneuploides, incluido ARNm de SERPINEB2, revestimiento B, SERPINB5 hipometilado del cromosoma 18, 4 específico de placenta (PLAC4), holocarboxilasa sintetasa hipermetilada (HLCS) y ARNm de c21orf105 del cromosoma 12. [64 ] Con la trisomía completa, los alelos de ARNm en el plasma materno no es la proporción normal de 1: 1, pero de hecho es 2: 1. Las proporciones alélicas determinadas por marcadores epigenéticos también pueden usarse para detectar las trisomías completas. La secuenciación paralela masiva y la PCR digital para la detección de aneuploidías fetales se pueden utilizar sin restricción a las moléculas de ácido nucleico específicas del feto. (MPSS) se estima que tiene una sensibilidad de entre el 96 y el 100% y una especificidad entre el 94 y el 100% para detectar el síndrome de Down. Se puede realizar a las 10 semanas de edad gestacional . [65] Un estudio en los Estados Unidos calculó una tasa de falsos positivos de 0.3% y un valor predictivo positivo de 80% cuando se usa cffDNA para detectar el síndrome de Down. [66]
Preeclampsia
La preeclampsia es una condición compleja del embarazo que involucra hipertensión y proteinuria generalmente después de las 20 semanas de gestación. [67] Se relaciona con una invasión citotrofoblástica deficiente del miometrio . El inicio de la afección entre las 20 y 34 semanas de gestación se considera "temprano". [68] Las muestras de plasma materno en embarazos complicados por preeclampsia tienen niveles significativamente más altos de cffDNA que en embarazos normales. [69] [70] [71] Esto es válido para la preeclampsia de inicio temprano. [68]
Perspectivas futuras
Puede usarse secuenciación de nueva generación para producir una secuencia del genoma completo a partir de cffDNA. Esto plantea cuestiones éticas. [72] Sin embargo, la utilidad del procedimiento puede aumentar a medida que se descubren asociaciones claras entre variantes genéticas específicas y estados patológicos. [73] [74]
Ver también
- Prueba triple
- Prueba cuádruple
- Microquimerismo
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