El aislamiento celular es el proceso de separar células vivas individuales de un bloque sólido de tejido o suspensión celular. Si bien algunos tipos de células existen naturalmente en forma separada (por ejemplo, células sanguíneas ), otros tipos de células que se encuentran en el tejido sólido requieren técnicas específicas para separarlas en células individuales. Esto se puede realizar utilizando enzimas para digerir las proteínas que unen estas células dentro de la matriz extracelular . Una vez que se han digerido las proteínas de la matriz, las células permanecen unidas entre sí de forma flexible, pero pueden separarse mecánicamente con suavidad. Después del aislamiento, se pueden realizar experimentos en estas células aisladas individuales que incluyenelectrofisiología de pinza de parche , imágenes de fluorescencia de calcio e inmunocitoquímica .
Técnicas
Células circulantes
Las técnicas necesarias para obtener células aisladas varían según el tipo de célula requerido. Las células circulantes como las células sanguíneas o algunas células tumorales se pueden aislar tomando una muestra de sangre. [1] Como las muestras de sangre contienen una mezcla de muchos tipos de células diferentes, se debe utilizar un método para separar las células en diferentes tipos. El método más comúnmente utilizado para esto es la citometría de flujo, durante la cual un analizador automático inspecciona un flujo estrecho de células. En una versión de esta técnica, se hace brillar una luz sobre el flujo de células y el analizador detecta la luz reflejada o la fluorescencia antes de usar esta información para maniobrar rápidamente las células de interés en una cámara de recolección. [2]
Tejidos sólidos
Cuando se trata de tejidos sólidos, la obtención de tejido para el aislamiento celular puede resultar más difícil. En ocasiones, se puede obtener tejido humano excedente en el momento de la cirugía planificada, por ejemplo, las muestras de la orejuela auricular derecha a menudo se extirpan y se desechan durante una cirugía a corazón abierto , como la cirugía de derivación de la arteria coronaria . [3] Se pueden tomar otros tejidos como muestras de páncreas o vejiga como biopsia. Alternativamente, el tejido de animales se obtiene con frecuencia sacrificando al animal. [4]
Después de obtener una muestra de tejido, debe rodearse o perfundirse con una solución a una temperatura adecuada que contenga las sales y los nutrientes necesarios para mantener vivas las células. Esto puede realizarse simplemente sumergiendo el tejido en la solución, o puede involucrar arreglos más complejos como la perfusión de Langendorff . [3] Las soluciones de uso común incluían modificaciones de la solución de Tyrode o de la solución de Krebs y Henseleit. Estas soluciones contienen concentraciones precisas de electrolitos que incluyen sodio , potasio , calcio , magnesio , fosfato , cloruro y glucosa . Las concentraciones de estos electrolitos deben equilibrarse cuidadosamente, prestando atención a la presión osmótica. La acidez de la solución debe regularse, a menudo utilizando un tampón de pH como HEPES . El aislamiento de células de algunos tejidos se puede mejorar oxigenando la solución. [3] En las etapas iniciales, perfundir el tejido con una solución que no contenga calcio es útil particularmente cuando se aíslan miocitos cardíacos , ya que la ausencia de calcio provoca la separación de los discos intercalados . [5]
A continuación, se pueden añadir enzimas proteolíticas a la solución. Las enzimas que digieren el colágeno ( colagenasas ) se utilizan a menudo para aislar células del corazón o la vejiga. [3] [4] [6] También se pueden usar enzimas de uso general que digieren muchos tipos de proteínas ( proteasas ). [3] Al aislar células del tejido cerebral, es posible que se requieran otras enzimas que descomponen el ADN (ADNasas). [7]
Estas enzimas, además de digerir la matriz extracelular, también pueden digerir otras proteínas importantes esenciales para el funcionamiento de las células de interés. Si las células se exponen a estas enzimas durante demasiado tiempo, se produce la muerte celular, pero si no se exponen a las enzimas durante el tiempo suficiente, la digestión de la matriz extracelular no será completa. Una vez que las enzimas se han eliminado del tejido perfundiéndolo con una segunda solución que no contiene enzimas, las células pueden separarse o disociarse mecánicamente. Una técnica simple para disociar células consiste en cortar el tejido en pequeños trozos antes de agitar los trozos en una solución con una pipeta. [3] [4]
Usos
Las células aisladas se pueden utilizar para estudiar cómo funcionan las células, cómo cambian en respuesta a una enfermedad y cómo se ven afectadas por los medicamentos. Un ejemplo de una técnica experimental que utiliza células aisladas es la electrofisiología de pinza de parche , que se utiliza para estudiar cómo fluyen las partículas cargadas a través de la membrana celular . Las técnicas complementarias incluyen imágenes de fluorescencia de calcio usando tintes que emiten luz en respuesta al calcio para medir cómo se regula el calcio dentro de la célula, e inmunocitoquímica que usa anticuerpos marcados con un marcador fluorescente para identificar dónde se encuentran las proteínas dentro de una célula. [8] Las células aisladas también se pueden utilizar para el cultivo celular , en el que una sola célula se multiplica para crear una colonia de células. [4]
El aislamiento celular también se puede utilizar como parte de un tratamiento. El aislamiento de las células de los islotes pancreáticos, seguido de su posterior cultivo y trasplante, se ha utilizado para tratar a pacientes con diabetes tipo 1 . [9]
Ver también
- Clasificación celular
Referencias
- ^ Bhagwat N, Carpenter EL (2017). "Métodos de citometría de flujo para el aislamiento de células tumorales circulantes y análisis molecular". Avances en Medicina y Biología Experimental . 994 : 105-118. doi : 10.1007 / 978-3-319-55947-6_5 . PMID 28560670 .
- ^ Hu P, Zhang W, Xin H, Deng G (2016). "Aislamiento y análisis unicelular" . Fronteras en biología celular y del desarrollo . 4 : 116. doi : 10.3389 / fcell.2016.00116 . PMC 5078503 . PMID 27826548 .
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- ^ Chew LJ, DeBoy CA, Senatorov VV (octubre de 2014). "Encontrar grados de separación: enfoques experimentales para el aislamiento de células astrogliales y oligodendrogliales y orientación genética" . Revista de métodos de neurociencia . 236 : 125–47. doi : 10.1016 / j.jneumeth.2014.08.017 . PMC 4171043 . PMID 25169049 .
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Otras lecturas
- Aislamiento de cardiomiocitos auriculares: Voigt N, Pearman CM, Dobrev D, Dibb KM (septiembre de 2015). "Métodos para aislar células auriculares de grandes mamíferos y humanos" . Revista de Cardiología Molecular y Celular . 86 : 187–98. doi : 10.1016 / j.yjmcc.2015.07.006 . PMID 26186893 .
- Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares: Louch WE, Sheehan KA, Wolska BM (septiembre de 2011). "Métodos de aislamiento, cultivo y transferencia de genes de cardiomiocitos" . Revista de Cardiología Molecular y Celular . 51 (3): 288–98. doi : 10.1016 / j.yjmcc.2011.06.012 . PMC 3164875 . PMID 21723873 .
- Aislamiento de células de los islotes pancreáticos: Ricordi C, Lacy PE, Finke EH, Olack BJ, Scharp DW (abril de 1988). "Método automatizado para el aislamiento de islotes pancreáticos humanos". Diabetes . 37 (4): 413-20. doi : 10.2337 / diab.37.4.413 . PMID 3288530 .
- Aislamiento de células madre hematopoyéticas: Rector K, Liu Y, Van Zant G (2013). "Métodos integrales de aislamiento de células madre hematopoyéticas". Métodos en Biología Molecular . 976 : 1-15. doi : 10.1007 / 978-1-62703-317-6_1 . PMID 23400430 .
- Aislamiento de células madre mesenquimales: Yosupov N, Haimov H, Juodzbalys G (2017). "Movilización, aislamiento y caracterización de células madre de sangre periférica: una revisión sistemática" . Revista de Investigación Oral y Maxilofacial . 8 (1): e1. doi : 10.5037 / jomr.2017.8101 . PMC 5423306 . PMID 28496961 .
- Aislamiento de células estrelladas hepáticas: Shang L, Hosseini M, Liu X, Kisseleva T, Brenner DA (enero de 2018). "Caracterización y aislamiento de células estrelladas hepáticas humanas" . Revista de gastroenterología . 53 (1): 6–17. doi : 10.1007 / s00535-017-1404-4 . PMID 29094206 .
- Aislamiento de células tumorales circulantes: Bhagwat N, Carpenter EL (2017). "Métodos de citometría de flujo para el aislamiento de células tumorales circulantes y análisis molecular". Avances en Medicina y Biología Experimental . 994 : 105-118. doi : 10.1007 / 978-3-319-55947-6_5 . PMID 28560670 .
- Aislamiento de células neurogliales: Chew LJ, DeBoy CA, Senatorov VV (octubre de 2014). "Encontrar grados de separación: enfoques experimentales para el aislamiento de células astrogliales y oligodendrogliales y orientación genética" . Revista de métodos de neurociencia . 236 : 125–47. doi : 10.1016 / j.jneumeth.2014.08.017 . PMC 4171043 . PMID 25169049 .
- Aislamiento de células uroteliales: Kloskowski T, Uzarska M, Gurtowska N, Olkowska J, Joachimiak R, Bajek A, Gagat M, Grzanka A, Bodnar M, Marszałek A, Drewa T (abril de 2014). "¿Cómo aislar las células uroteliales? Comparación de cuatro métodos diferentes y revisión de la literatura". Célula humana . 27 (2): 85–93. doi : 10.1007 / s13577-013-0070-y . PMID 24368576 .