La desamidación es una reacción química en la que un grupo funcional amida en la cadena lateral de los aminoácidos asparagina o glutamina se elimina o se convierte en otro grupo funcional. Normalmente, la asparagina se convierte en ácido aspártico o ácido isoaspártico . La glutamina se convierte en ácido glutámico o ácido piroglutámico (5-oxoprolina). En una proteína o péptido , estas reacciones son importantes porque pueden alterar su estructura, estabilidad o función y pueden conducir a la degradación de las proteínas. El cambio químico neto es la adición de un grupo de agua y la eliminación de un grupo de amoníaco, lo que corresponde a un aumento de masa de +1 (0,98402) Da. Aunque la desamidación se produce en glutamina, asparagina glicosilada y otras amidas, estas son insignificantes en condiciones típicas de proteólisis. [1]
En la desamidación de un residuo de asparagina en condiciones fisiológicas, la cadena lateral es atacada por el átomo de nitrógeno del siguiente grupo peptídico (en negro en la parte superior derecha de la Figura), formando un intermedio de succinimida asimétrico (en rojo). La asimetría del intermedio da como resultado dos productos de su hidrólisis, ya sea ácido aspártico (en negro a la izquierda) o ácido isoaspártico , que es un aminoácido beta (en verde en la parte inferior derecha). Sin embargo, existe la preocupación de que el ácido aspártico pueda isomerizarse después de la desamidación. [2] La desamidación de un residuo de glutamina puede proceder a través del mismo mecanismo pero a una velocidad mucho más lenta, ya que la formación del intermedio de glutarimida de anillo de seis miembros es menos favorecida que el intermedio de succinimida para la asparagina. En general, la desamidación puede eliminarse mediante proteólisis a un pH ácido o a un pH ligeramente básico (4,5 y 8,0, respectivamente) utilizando la endoproteasa Glu-C. [2]
Las tasas de desamidación dependen de múltiples factores, incluidas las secuencias primarias y las estructuras de orden superior de las proteínas, el pH, la temperatura y los componentes de las soluciones. La mayoría de los sitios de desamidación potenciales están estabilizados por una estructura de orden superior. Asn-Gly (NG), es el más flexible y, dado que es ácido, es más propenso a la desamidación con una vida media de alrededor de 24 h en condiciones fisiológicas (pH 7,4, 37 ° C). [3]
Como aminoácido libre, o como residuo N-terminal de un péptido o proteína, la glutamina se desamida fácilmente para formar ácido piroglutámico (5-oxoprolina). La reacción procede a través del ataque nucleofílico del grupo α-amino en la amida de la cadena lateral para formar una γ-lactama con la eliminación del amoníaco de la cadena lateral.
Método analítico
La desamidación de proteínas se ha analizado habitualmente mediante cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) mediante mapeo de péptidos. El nuevo método ERLIC-MS / MS del que se ha informado recientemente mejoraría la separación de péptidos desamidados y no desamidados con una mayor identificación y cuantificación. [4]
La espectrometría de masas se usa comúnmente para caracterizar los estados de desamidación de proteínas, incluidos los anticuerpos monoclonales terapéuticos. [5] La técnica es especialmente útil para el análisis de desamidación debido a su alta sensibilidad, velocidad y especificidad. Esto permite un análisis de desamidación específico del sitio. [6]
Un desafío importante del uso de la espectrometría de masas es la formación de artefactos de desamidación durante la preparación de la muestra. Estos artefactos sesgan significativamente los resultados porque sugieren mayores tasas de desamidación espontánea de lo que realmente se observa. Esto puede resultar problemático en el caso de proteínas terapéuticas que pueden caracterizarse erróneamente en los protocolos de control de calidad si un gran porcentaje de la desamidación detectada se debe a artefactos. Estudios recientes indican que un pH más bajo puede reducir la tasa de artefactos de desamidación. [2]
Cinética de la desamidación
Se ha conjeturado que las reacciones de desamidación son uno de los factores que limitan la vida útil de las proteínas. [1]
La desamidación procede mucho más rápidamente si al aminoácido susceptible le sigue un residuo pequeño y flexible, como la glicina, cuyo bajo impedimento estérico deja al grupo de péptidos abierto al ataque. Las reacciones de desamidación también proceden mucho más rápidamente a pH y temperatura elevados (> 10) .
La endoproteasa, Glu-C, ha mostrado especificidad solo para el ácido glutámico cuando está en condiciones de pH específicas (4.5 y 8.0) y escindió el lado C-terminal cuando está en una solución con Tris-HCl, bicarbonato o acetato.
Ver también
Referencias
- ↑ a b Clarke, S (2003). "El envejecimiento como guerra entre procesos químicos y bioquímicos: metilación de proteínas y el reconocimiento de proteínas dañadas por la edad para su reparación". El envejecimiento Res Rev . 2 : 263-285. doi : 10.1016 / S1568-1637 (03) 00011-4 .
- ^ a b c Liu, Shanshan; Moulton, Kevin Ryan; Auclair, Jared Robert; Zhou, Zhaohui Sunny (1 de abril de 2016). "Las condiciones ligeramente ácidas eliminan el artefacto de desamidación durante la proteólisis: digestión con endoproteasa Glu-C a pH 4,5" . Aminoácidos . 48 (4): 1059–1067. doi : 10.1007 / s00726-015-2166-z . ISSN 1438-2199 . PMC 4795971 . PMID 26748652 .
- ^ Tyler-Cross R, Schirch V (1991) Efectos de la secuencia de aminoácidos, tampones y fuerza iónica sobre la velocidad y el mecanismo de desamidación de residuos de asparagina en péptidos pequeños. J Biol Chem 266: 22549–22556
- ^ Zhen, Jing (2018). "Caracterización de anticuerpos utilizando el mapeo de péptidos basado en ERLIC-MS / MS novela" . mAbs . 10 : 1–9. doi : 10.1080 / 19420862.2018.1505179 . PMC 6204790 . PMID 30130443 .
- ^ Wang, Weijie; Meeler, Andrea R .; Bergerud, Luke T .; Hesselberg, Mark; Byrne, Michael; Wu, Zhuchun (2012). "Cuantificación y caracterización de la desamidación de anticuerpos mediante mapeo de péptidos con espectrometría de masas". Revista Internacional de Espectrometría de Masas . 312 : 107-113. doi : 10.1016 / j.ijms.2011.06.006 .
- ^ Hao, Piliang; Adav, Sunil S .; Gallart-Palau, Xavier; Sze, Siu Kwan (noviembre de 2017). "Avances recientes en el análisis espectrométrico de masas de la desamidación de proteínas". Revisiones de espectrometría de masas . 36 (6): 677–692. doi : 10.1002 / mas.21491 . ISSN 1098-2787 . PMID 26763661 .
- Clarke, S (1987). "Propensión a la formación espontánea de succinimida a partir de residuos de aspartilo y asparaginilo en proteínas celulares". En t. J., Peptide Protein Res . 30 : 808–821. PMID 3440704 .
- Stephenson, RC; Clarke, S (1989). "Formación de succinimida a partir de péptidos de aspartilo y asparaginilo como modelo para la degradación espontánea de proteínas". J. Biol. Chem . 264 : 6164–6170. PMID 2703484 .
- Robinson NE, Robinson AB. (2004) Relojes moleculares: desamidación de residuos de asparaginilo y glutaminilo en péptidos y proteínas. Prensa de Althouse: Cave Junction, Ore. OCLC 56978028