El perfil de secuencia final (ESP) (a veces "mapeo de extremos emparejados (PEM)") es un método basado en conectores con etiquetas de secuencia desarrollados para facilitar la secuenciación del genoma de novo para identificar el número de copias de alta resolución y las aberraciones estructurales, como inversiones y translocaciones .
Brevemente, el ADN genómico diana se aísla y se digiere parcialmente con enzimas de restricción en grandes fragmentos. Después del fraccionamiento por tamaño, los fragmentos se clonan en plásmidos para construir cromosomas artificiales tales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que luego se secuencian y comparan con el genoma de referencia. Las diferencias, incluidas las variaciones de orientación y longitud entre los cromosomas construidos y el genoma de referencia, sugerirán número de copias y aberración estructural.
Construcción de cromosomas artificiales
Antes de analizar la aberración estructural del genoma diana y la variación del número de copias (CNV) con ESP, el genoma diana generalmente se amplifica y conserva con la construcción de cromosomas artificiales. La estrategia clásica para construir un cromosoma artificial es el cromosoma artificial bacteriano (BAC). Básicamente, el cromosoma diana se digiere al azar y se inserta en plásmidos que se transforman y clonan en bacterias. [1] El tamaño de los fragmentos insertados es de 150 a 350 kb. [2] Otro cromosoma artificial de uso común es el fosmid. La diferencia entre BAC y fosmids es el tamaño del ADN insertado. Los fosmidos solo pueden contener fragmentos de ADN de 40 kb, [3] lo que permite una determinación más precisa del punto de corte.
Detección de aberraciones estructurales
El perfil de secuencia final (ESP) se puede utilizar para detectar variaciones estructurales como inserciones, deleciones y reordenamiento cromosómico. En comparación con otros métodos que analizan las anomalías cromosómicas, la ESP es particularmente útil para identificar anomalías de copia neutra, como inversiones y translocaciones que no serían evidentes al observar la variación del número de copias. [4] [5] De la biblioteca BAC, ambos extremos de los fragmentos insertados se secuencian usando una plataforma de secuenciación. La detección de variaciones se logra entonces mapeando las lecturas secuenciadas en un genoma de referencia.
Inversión y translocación
Las inversiones y traslocaciones son relativamente fáciles de detectar mediante un par no válido de extremos secuenciados. Por ejemplo, se puede detectar una translocación si los extremos emparejados se mapean en diferentes cromosomas en el genoma de referencia. [4] [5] La inversión se puede detectar mediante la orientación divergente de las lecturas, donde el inserto tendrá dos extremos positivos o dos extremos negativos.
Inserción y eliminación
En el caso de una inserción o deleción, el mapeo del extremo emparejado es consistente con el genoma de referencia. Pero las leídas son discordantes en tamaño aparente. El tamaño aparente es la distancia de los extremos secuenciados de BAC mapeados en el genoma de referencia. Si un BAC tiene un inserto de longitud (l), un mapeo concordante mostrará un fragmento de tamaño (l) en el genoma de referencia. Si los extremos emparejados están más cerca que la distancia (l), se sospecha una inserción en el ADN muestreado. Se puede utilizar una distancia de (l <μ-3σ) como corte para detectar una inserción, donde μ es la longitud media del inserto y σ es la desviación estándar. [5] [6] En caso de una deleción, los extremos emparejados se mapean más lejos en el genoma de referencia en comparación con la distancia esperada (l> μ-3σ). [6]
Variación del número de copias
En algunos casos, las lecturas discordantes también pueden indicar una CNV, por ejemplo, en las repeticiones de secuencias. Para CNV más grande, la densidad de las lecturas variará de acuerdo con el número de copias. Un aumento del número de copias se reflejará aumentando el mapeo de la misma región en el genoma de referencia.
Historia de ESP
ESP fue desarrollado y publicado por primera vez en 2003 por el Dr. Collins y sus colegas en la Universidad de California, San Francisco. Su estudio reveló los reordenamientos cromosómicos y la CNV de las células cancerosas humanas MCF7 a una resolución de 150 kb, que es mucho más precisa en comparación con la CGH y el cariotipo espectral en ese momento. [5] En 2007, el Dr. Snyder y su grupo mejoraron el ESP a una resolución de 3 kb secuenciando ambos pares de fragmentos de ADN de 3 kb sin construcción de BAC. Su enfoque es capaz de identificar deleciones, inversiones e inserciones con una resolución de punto de ruptura promedio de 644 pb, que se acerca a la resolución de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [7]
Aplicaciones ESP
Se pueden utilizar varias herramientas bioinformáticas para analizar el perfil de la secuencia final. Los más comunes incluyen BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, common LAW, GASV y Spanner. [8] ESP se puede utilizar para mapear la variación estructural a alta resolución en el tejido enfermo. Esta técnica se utiliza principalmente en muestras de tumores de diferentes tipos de cáncer. La identificación precisa de anomalías cromosómicas de copia neutral es particularmente importante, ya que la translocación puede conducir a proteínas de fusión, proteínas quiméricas o proteínas mal reguladas que se pueden observar en los tumores. Esta técnica también se puede utilizar en estudios de evolución al identificar una gran variación estructural entre diferentes poblaciones. [9] Se están desarrollando métodos similares para diversas aplicaciones. Por ejemplo, se utilizó un enfoque de secuenciación de extremos emparejados de Illumina con código de barras (BIPES) para evaluar la diversidad microbiana mediante la secuenciación de la etiqueta 16S V6. [10]
Ventajas y limitaciones
La resolución de la detección de variación estructural por ESP se ha incrementado a un nivel similar al de la PCR, y puede mejorarse aún más mediante la selección de fragmentos de ADN de tamaño más uniforme. El ESP puede aplicarse con o sin cromosoma artificial construido. Con BAC, las muestras preciosas se pueden inmortalizar y conservar, lo que es particularmente importante para pequeñas cantidades de pequeñas que están planificadas para análisis extensos. Además, los BAC que llevan fragmentos de ADN reorganizados pueden transfectarse directamente in vitro o in vivo para analizar la función de estas disposiciones. Sin embargo, la construcción de BAC sigue siendo cara y requiere mucha mano de obra. Los investigadores deben tener mucho cuidado al elegir qué estrategia necesitan para un proyecto en particular. Debido a que la ESP solo mira secuencias cortas de extremos emparejados, tiene la ventaja de proporcionar información útil en todo el genoma sin la necesidad de una secuenciación a gran escala. Aproximadamente 100-200 tumores se pueden secuenciar a una resolución superior a 150 kb en comparación con la secuenciación de un genoma completo.
Referencias
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Ver también
- Anomalías cromosómicas
- Inversión cromosómica
- Inserción (genética)
- Deleción (genética)
- Translocación cromosómica
- Anomalía cromosómica
- Variación del número de copias