El silenciamiento de genes es la regulación de la expresión génica en una célula para prevenir la expresión de un determinado gen . [1] [2] El silenciamiento de genes puede ocurrir durante la transcripción o la traducción y se usa a menudo en la investigación. [1] [2] En particular, los métodos utilizados para silenciar genes se utilizan cada vez más para producir fármacos para combatir el cáncer y otras enfermedades, como enfermedades infecciosas y trastornos neurodegenerativos .
El silenciamiento de genes a menudo se considera lo mismo que la eliminación de genes . [3] [4] Cuando los genes se silencian, su expresión se reduce. [3] [4] Por el contrario, cuando los genes se eliminan, se borran por completo del genoma del organismo y, por lo tanto, no tienen expresión. [3] [4] El silenciamiento de genes se considera un mecanismo de eliminación de genes debido a que los métodos utilizados para silenciar genes, como ARNi , CRISPR o ARNip, generalmente reducen la expresión de un gen en al menos un 70% pero no lo eliminan. Los métodos que utilizan el silenciamiento de genes a menudo se consideran mejores que los noqueadores de genes, ya que permiten a los investigadores estudiar genes esenciales que se requieren para que los modelos animales sobrevivan y no se pueden eliminar. Además, proporcionan una visión más completa del desarrollo de enfermedades, ya que las enfermedades generalmente se asocian con genes que tienen una expresión reducida. [3]
Tipos
Transcripcional
- Huella genética
- Paramutación
- Silenciamiento de transposones (o modificaciones de histonas)
- Silenciamiento de transgenes
- Efecto de posición
- Metilación de ADN dirigida por ARN
Post-transcripcional
Meiótico
Métodos de búsqueda
Oligonucleótidos antisentido
Los oligonucleótidos antisentido fueron descubiertos en 1978 por Paul Zamecnik y Mary Stephenson. [5] Los oligonucleótidos , que son fragmentos cortos de ácido nucleico , se unen a moléculas de ARNm diana complementarias cuando se agregan a la célula. [5] [6] Estas moléculas pueden estar compuestas de ADN o ARN monocatenario y generalmente tienen entre 13 y 25 nucleótidos de longitud. [6] [7] Los oligonucleótidos antisentido pueden afectar la expresión génica de dos formas: mediante el uso de un mecanismo dependiente de RNasa H o mediante el uso de un mecanismo de bloqueo estérico. [6] [7] Los oligonucleótidos dependientes de ARNasa H provocan la degradación de las moléculas de ARNm diana , mientras que los oligonucleótidos bloqueadores estéricos evitan la traducción de la molécula de ARNm. [6] [7] La mayoría de los fármacos antisentido funcionan a través del mecanismo dependiente de la ARNasa H, en el que la ARNasa H hidroliza la cadena de ARN del heterodúplex ADN / ARN . [6] [7] Se cree que este mecanismo es más eficiente, lo que resulta en una disminución de aproximadamente 80% a 95% en la expresión de proteínas y ARNm. [6]
Ribozimas
Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que se utilizan para inhibir la expresión génica . Estas moléculas funcionan escindiendo moléculas de ARNm , esencialmente silenciando los genes que las produjeron. Sidney Altman y Thomas Cech descubrieron por primera vez las moléculas de ARN catalítico, la ARNasa P y las ribozimas intrónicas del grupo II, en 1989 y ganaron el Premio Nobel por su descubrimiento. [8] [9] Existen varios tipos de motivos de ribozimas, incluyendo cabeza de martillo , horquilla , virus delta de la hepatitis , del grupo I , grupo II , y RNasa P ribozimas. Los motivos de ribozimas del virus de la cabeza de martillo, la horquilla y el virus de la hepatitis delta (HDV) se encuentran generalmente en virus o ARN de viroides. [8] Estos motivos pueden autoescindir un enlace fosfodiéster específico en una molécula de ARNm. [8] Los eucariotas inferiores y algunas bacterias contienen ribozimas del grupo I y del grupo II. [8] Estos motivos pueden auto-empalmarse escindiendo y uniendo enlaces fosfodiéster. [8] El último motivo de ribozima, la ribozima RNasa P, se encuentra en Escherichia coli y es conocida por su capacidad para escindir los enlaces fosfodiéster de varios precursores de tRNA cuando se unen a un cofactor de proteína. [8]
El mecanismo catalítico general utilizado por las ribozimas es similar al mecanismo utilizado por las proteínas ribonucleasas . [10] Estas moléculas catalíticas de ARN se unen a un sitio específico y atacan al fosfato vecino en la columna vertebral del ARN con su oxígeno 2 ', que actúa como un nucleófilo , lo que da como resultado la formación de productos escindidos con un fosfato cíclico 2'3' y un extremo terminal hidroxilo 5 '. [10] Los científicos han utilizado cada vez más este mecanismo catalítico para realizar la escisión de secuencias específicas de moléculas de ARNm diana. Además, se está intentando utilizar ribozimas para producir terapias de silenciamiento de genes, que silenciarían los genes responsables de causar enfermedades. [11]
Interferencia de ARN
La interferencia de ARN ( ARNi ) es un proceso natural utilizado por las células para regular la expresión génica. Fue descubierto en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello , quienes ganaron el Premio Nobel por su descubrimiento en 2006. [12] El proceso para silenciar los genes comienza con la entrada de una molécula de ARN bicatenario (dsRNA) en la célula. que desencadena la vía del ARNi. [12] La molécula bicatenaria se corta luego en pequeños fragmentos bicatenarios mediante una enzima llamada Dicer . [12] Estos pequeños fragmentos, que incluyen pequeños ARN interferentes (ARNip) y microARN (miARN) , tienen aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de longitud. [12] [13] Los fragmentos se integran en una proteína de múltiples subunidades llamada complejo de silenciamiento inducido por ARN , que contiene proteínas Argonaute que son componentes esenciales de la vía del ARNi. [12] [13] Una hebra de la molécula, llamada hebra "guía", se une a RISC, mientras que la otra hebra, conocida como hebra "pasajera" se degrada. [12] [13] La cadena guía o antisentido del fragmento que permanece unido a RISC dirige el silenciamiento específico de secuencia de la molécula de ARNm diana. [13] Los genes pueden ser silenciados por moléculas de ARNip que provocan la escisión endonucleática de las moléculas de ARNm diana o por moléculas de miARN que suprimen la traducción de la molécula de ARNm. [13] Con la escisión o represión traduccional de las moléculas de ARNm, los genes que las forman se vuelven esencialmente inactivos. [12] Se cree que el ARNi ha evolucionado como un mecanismo de defensa celular contra invasores, como los virus ARN , o para combatir la proliferación de transposones dentro del ADN de una célula. [12] Tanto los virus ARN como los transposones pueden existir como ARN bicatenario y dar lugar a la activación de ARNi. [12] Actualmente, los ARNip se utilizan ampliamente para suprimir la expresión de genes específicos y evaluar la función de los genes . Las empresas que utilizan este enfoque incluyen Alnylam , Sanofi , [14] Arrowhead , Discerna , [15] y Persomics , [16] entre otras.
Tres regiones primarias sin traducir y microARN
Las tres regiones primarias no traducidas (3'UTR) de los ARN mensajeros (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que causan silenciamiento génico postranscripcionalmente. Tales 3'-UTR a menudo contienen sitios de unión tanto para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras . Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, una gran cantidad de miARN específicos disminuyen la expresión génica de sus ARNm diana particulares ya sea inhibiendo la traducción o causando directamente la degradación del transcrito, utilizando un mecanismo similar a la interferencia del ARN (ver MicroARN ). El 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.
El 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de microARN (MRE) . Las MRE son secuencias a las que se unen los miARN y provocan el silenciamiento génico. Estos son motivos prevalentes dentro de 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.
A partir de 2014, el sitio web miRBase , [17] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN , enumeró 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estos, 1.881 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que cada miARN tenía un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (lo que provoca el silenciamiento génico de varios cientos de genes). [18] Freidman y col. [18] estiman que> 45.000 sitios diana de miARN dentro de las 3'UTR de ARNm humano se conservan por encima de los niveles de fondo, y> 60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el apareamiento con los miARN.
Los experimentos directos muestran que un solo miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de mRNA únicos. [19] Otros experimentos muestran que un solo miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos del doble). [20] [21]
Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN parecen ser importantes en el cáncer. [22] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, nueve miARN han sido identificados como alterados epigenéticamente y efectivos para regular a la baja las enzimas reparadoras del ADN. [23]
Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN también parecen ser importantes en los trastornos neuropsiquiátricos , como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [24] [25] [26]
Aplicaciones
Investigación médica
Los investigadores han utilizado ampliamente las técnicas de silenciamiento de genes para estudiar genes asociados con trastornos. Estos trastornos incluyen cáncer , enfermedades infecciosas , enfermedades respiratorias y trastornos neurodegenerativos . El silenciamiento génico también está siendo utilizado en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos, tales como la letalidad sintética , de alto rendimiento de cribado , y pantallas de RNAi miniaturizados .
Cáncer
La interferencia de ARN se ha utilizado para silenciar genes asociados con varios cánceres. En estudios in vitro de leucemia mielógena crónica (LMC) , se utilizó ARNip para escindir la proteína de fusión, BCR-ABL , que evita que el fármaco Gleevec ( imatinib ) se una a las células cancerosas. [27] La escisión de la proteína de fusión redujo la cantidad de células hematopoyéticas transformadas que se diseminan por todo el cuerpo al aumentar la sensibilidad de las células al fármaco. [27] La interferencia de ARN también se puede utilizar para apuntar a mutantes específicos. Por ejemplo, los ARNip pudieron unirse específicamente a moléculas supresoras de tumores p53 que contenían una mutación puntual única y destruirla, dejando intacto el supresor de tipo salvaje. [28]
Los receptores involucrados en las rutas mitogénicas que conducen a una mayor producción de células cancerosas también han sido atacados por moléculas de ARNip. El receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) , asociado con la proliferación del cáncer de mama, fue escindido por moléculas de ARNip que redujeron el número de divisiones comúnmente observadas por las células cancerosas. [29] Los investigadores también han utilizado ARNip para regular selectivamente la expresión de genes relacionados con el cáncer. Las proteínas antiapoptóticas, como la clusterina y la survivina , a menudo se expresan en las células cancerosas. [30] [31] Los ARNip dirigidos a la clusterina y la survivina se usaron para reducir la cantidad de proteínas antiapoptóticas y, por lo tanto, aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a los tratamientos de quimioterapia. [30] [31] Los estudios in vivo también se utilizan cada vez más para estudiar el uso potencial de moléculas de ARNip en la terapéutica del cáncer. Por ejemplo, se descubrió que los ratones a los que se les implantaron células de adenocarcinoma de colon sobrevivieron más tiempo cuando las células se pretrataron con ARNip que se dirigían a la B-catenina en las células cancerosas. [32]
Enfermedad infecciosa
Virus
Los genes virales y los genes del huésped que son necesarios para que los virus se repliquen o entren en la célula, o que desempeñan un papel importante en el ciclo de vida del virus, a menudo son el objetivo de las terapias antivirales. El ARNi se ha utilizado para atacar genes en varias enfermedades virales, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la hepatitis . [33] [34] En particular, se utilizó ARNip para silenciar el receptor primario de quimiocinas del receptor 5 del VIH (CCR5). [35] Esto impidió que el virus entrara en los linfocitos de sangre periférica humana y en las células madre hematopoyéticas primarias. [35] [36] Se utilizó una técnica similar para disminuir la cantidad de virus detectable en las células infectadas con hepatitis B y C. En la hepatitis B, se utilizó el silenciamiento de ARNip para apuntar al antígeno de superficie en el virus de la hepatitis B y condujo a una disminución en el número de componentes virales. [37] Además, las técnicas de ARNip utilizadas en la hepatitis C pudieron reducir la cantidad del virus en la célula en un 98%. [38] [39]
La interferencia de ARN se ha utilizado comercialmente para controlar las enfermedades virales de las plantas durante más de 20 años (consulte Resistencia a las enfermedades de las plantas ). En 1986-1990, se publicaron múltiples ejemplos de "resistencia mediada por proteínas de la cubierta" contra virus de plantas, antes de que se descubriera el ARNi. [40] En 1993, el trabajo con el virus del grabado del tabaco demostró por primera vez que los organismos huéspedes pueden apuntar a secuencias de ARNm o virus específicos para su degradación, y que esta actividad es el mecanismo detrás de algunos ejemplos de resistencia a virus en plantas transgénicas. [41] [42] El descubrimiento de pequeños ARN interferentes (el determinante de la especificidad en el silenciamiento génico mediado por ARN) también utilizó el silenciamiento génico postranscripcional inducido por virus en plantas. [43] En 1994, se habían generado variedades de calabaza transgénicas que expresaban genes de proteínas de la cubierta de tres virus diferentes, lo que proporcionaba a los híbridos de calabaza una resistencia multiviral validada en el campo que sigue utilizándose comercialmente en la actualidad. Las líneas de papa que expresan secuencias de replicasa viral que confieren resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de la papa se vendieron con los nombres comerciales NewLeaf Y y NewLeaf Plus, y fueron ampliamente aceptadas en la producción comercial en 1999-2001, hasta que McDonald's Corp. decidió no comprar papas transgénicas y Monsanto decidió para cerrar su negocio de patatas NatureMark. [44] Otro ejemplo citado con frecuencia de resistencia a virus mediada por silenciamiento de genes involucra a la papaya, donde la industria de la papaya hawaiana fue rescatada por papayas transgénicas resistentes a virus producidas y autorizadas por investigadores universitarios en lugar de una gran corporación. [45] Estas papayas también se siguen utilizando en la actualidad, aunque no sin una protesta pública significativa, [46] [47] que es notablemente menos evidente en los usos médicos del silenciamiento de genes.
También se han utilizado técnicas de silenciamiento de genes para atacar otros virus, como el virus del papiloma humano , el virus del Nilo Occidental y el virus Tulane. El gen E6 en muestras tumorales recuperadas de pacientes con el virus del papiloma humano se seleccionó como objetivo y se encontró que causaba apoptosis en las células infectadas. [48] Los vectores de expresión de ARNip de plásmidos utilizados para atacar el virus del Nilo Occidental también pudieron prevenir la replicación de virus en líneas celulares. [49] Además, se ha encontrado que el ARNip tiene éxito en la prevención de la replicación del virus Tulane, parte de la familia de virus Caliciviridae , al dirigirse a sus genes estructurales y no estructurales. [50] Al dirigirse al gen NTPasa, se demostró que una dosis de ARNip 4 horas antes de la infección controla la replicación del virus Tulane durante 48 horas después de la infección, lo que reduce el título viral hasta en 2,6 logaritmos. [50] Aunque el virus Tulane es específico de la especie y no afecta a los humanos, se ha demostrado que está estrechamente relacionado con el norovirus humano , que es la causa más común de gastroenteritis aguda y brotes de enfermedades transmitidas por alimentos en los Estados Unidos. [51] Los norovirus humanos son conocidos por ser difíciles de estudiar en el laboratorio, pero el virus Tulane ofrece un modelo a través del cual estudiar esta familia de virus con el objetivo clínico de desarrollar terapias que puedan usarse para tratar enfermedades causadas por norovirus humanos.
Bacterias
A diferencia de los virus, las bacterias no son tan susceptibles al silenciamiento por ARNip. [52] Esto se debe en gran parte a cómo se replican las bacterias. Las bacterias se replican fuera de la célula huésped y no contienen la maquinaria necesaria para que funcione el ARNi. [52] Sin embargo, las infecciones bacterianas aún pueden ser suprimidas por ARNip al dirigirse a los genes del huésped que están involucrados en la respuesta inmune causada por la infección o al dirigirse a los genes del huésped implicados en la mediación de la entrada de bacterias en las células. [52] [53] Por ejemplo, se utilizó ARNip para reducir la cantidad de citocinas proinflamatorias expresadas en las células de ratones tratados con lipopolisacárido (LPS) . [52] [54] La expresión reducida de la citocina inflamatoria, el factor de necrosis tumoral α (TNFα) , a su vez, provocó una reducción del choque séptico que sintieron los ratones tratados con LPS. [54] Además, se usó ARNip para evitar que la bacteria, Psueomonas aeruginosa , invade las células epiteliales pulmonares murinas al derribar el gen de la caveolina-2 (CAV2). [55] Por lo tanto, aunque las bacterias no pueden ser atacadas directamente por los mecanismos de ARNip, aún pueden verse afectadas por ARNsi cuando se atacan los componentes involucrados en la infección bacteriana.
Enfermedades respiratorias
Se han utilizado ribozimas, oligonucleótidos antisentido y, más recientemente, ARNi para dirigirse a moléculas de ARNm implicadas en el asma . [53] [56] Estos experimentos han sugerido que el ARNip se puede utilizar para combatir otras enfermedades respiratorias, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la fibrosis quística . [53] La EPOC se caracteriza por hiperplasia de células caliciformes e hipersecreción de moco . [57] Se encontró que la secreción de moco se redujo cuando el factor de crecimiento transformante (TGF) -α fue dirigido por ARNip en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas NCI-H292 . [58] Además de la hipersecreción de moco, la inflamación crónica y el tejido pulmonar dañado son características de la EPOC y el asma. Se cree que el factor de crecimiento transformante TGF-β juega un papel en estas manifestaciones. [59] [60] Como resultado, cuando se usó interferón (IFN) -γ para eliminar el TGF-β , se mejoró la fibrosis de los pulmones, causada por el daño y la cicatrización del tejido pulmonar. [61] [62]
Trastornos neurodegenerativos
enfermedad de Huntington
La enfermedad de Huntington (EH) es el resultado de una mutación en el gen de la huntingtina que provoca un exceso de repeticiones CAG. [63] El gen luego forma una proteína huntingtina mutada con repeticiones de poliglutamina cerca del extremo amino . [64] Esta enfermedad es incurable y se sabe que causa déficits motores, cognitivos y conductuales. [65] Los investigadores han estado buscando el silenciamiento de genes como un potencial terapéutico para la EH.
El silenciamiento de genes se puede utilizar para tratar la EH dirigiéndose a la proteína huntingtina mutante. La proteína huntingtina mutante se ha dirigido a través del silenciamiento génico que es específico de alelo utilizando oligonucleótidos específicos de alelo . En este método, los oligonucleótidos antisentido se utilizan para apuntar al polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) , que son cambios de un solo nucleótido en la secuencia de ADN, ya que se ha encontrado que los pacientes con EH comparten SNP comunes que están asociados con el alelo de huntingtina mutado. Se ha descubierto que aproximadamente el 85% de los pacientes con EH se pueden cubrir cuando se apunta a tres SNP. Además, cuando se usaron oligonucleótidos antisentido para apuntar a un SNP asociado a HD en ratones, hubo una disminución del 50% en la proteína huntingtina mutante. [63]
El silenciamiento génico no específico de alelos utilizando moléculas de ARNip también se ha utilizado para silenciar las proteínas huntingtina mutantes. A través de este enfoque, en lugar de apuntar a los SNP en la proteína mutada, se dirigen todas las proteínas de huntingtina normales y mutadas. Cuando se estudió en ratones, se descubrió que el ARNip podría reducir los niveles de huntingtina normal y mutante en un 75%. En este nivel, encontraron que los ratones desarrollaron un control motor mejorado y una tasa de supervivencia más larga en comparación con los controles. [63] Por lo tanto, los métodos de silenciamiento de genes pueden resultar beneficiosos en el tratamiento de la EH.
La esclerosis lateral amiotrófica
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , también llamada enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad de las neuronas motoras que afecta el cerebro y la médula espinal . La enfermedad hace que las neuronas motoras se degeneren, lo que eventualmente conduce a la muerte de las neuronas y a la degeneración muscular. [66] Se ha descubierto que cientos de mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa de Cu / Zn (SOD1) causan ELA. [67] Se ha utilizado el silenciamiento de genes para anular el mutante SOD1 que es característico de la ELA. [67] [68] En concreto, las moléculas de ARNip se han utilizado con éxito para apuntar al gen mutante SOD1 y reducir su expresión a través del silenciamiento génico específico de alelo. [67] [69]
Desafíos terapéuticos
Existen varios desafíos asociados con las terapias de silenciamiento génico, incluida la entrega y la especificidad para las células objetivo. Por ejemplo, para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, se deben administrar al cerebro moléculas para una posible terapia de silenciamiento génico. La barrera hematoencefálica dificulta la entrega de moléculas al cerebro a través del torrente sanguíneo al evitar el paso de la mayoría de las moléculas que se inyectan o absorben en la sangre. [63] [64] Por lo tanto, los investigadores han descubierto que deben inyectar directamente las moléculas o implantar bombas que las empujan hacia el cerebro. [63]
Sin embargo, una vez dentro del cerebro, las moléculas deben moverse dentro de las células objetivo. Con el fin de administrar de manera eficiente moléculas de ARNip en las células, se pueden usar vectores virales . [63] [65] No obstante, este método de administración también puede ser problemático ya que puede provocar una respuesta inmunitaria contra las moléculas. Además de la entrega, también se ha descubierto que la especificidad es un problema en el silenciamiento génico. Tanto los oligonucleótidos antisentido como las moléculas de ARNip pueden unirse potencialmente a la molécula de ARNm incorrecta. [63] Por lo tanto, los investigadores están buscando métodos más eficientes para administrar y desarrollar terapias específicas de silenciamiento de genes que aún sean seguras y efectivas.
Comida
Las manzanas árticas son un conjunto de manzanas registradas [70] que contienen un rasgo de no oscurecimiento creado mediante el silenciamiento de genes para reducir la expresión de la polifenol oxidasa (PPO). Es el primer producto alimenticio aprobado que utiliza esta técnica. [71]
Ver también
- CRISPR
- Interferencia de ARN dirigida por ADN
- Impulsión genética
- Derribo de genes
- PPRH
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enlaces externos
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