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Microfotografía de un corte histológico de piel humana preparada para inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo anti-IgA. La piel es de un paciente con púrpura de Henoch-Schönlein : se encuentran depósitos de IgA en las paredes de pequeños capilares superficiales (flechas amarillas). El área verde ondulada pálida en la parte superior es la epidermis , el área fibrosa inferior es la dermis .
Estas figuras demuestran el mecanismo básico de inmunofluorescencia. La inmunofluorescencia primaria se representa a la izquierda, que muestra un anticuerpo con un grupo fluoróforo unido directamente al epítopo del antígeno para el que es específico. Una vez que el anticuerpo se une al epítopo, la muestra se puede observar con un microscopio fluorescente para confirmar la presencia del antígeno en la muestra. Por el contrario, la inmunofluorescencia secundaria se representa a la derecha, lo que muestra que primero un anticuerpo primario no etiquetado se une al epítopo del antígeno en un mecanismo similar al descrito anteriormente. Sin embargo, una vez que los anticuerpos primarios se han unido a su objetivo, aparece un anticuerpo secundario (marcado con un fluoróforo). Los sitios de unión de este anticuerpo secundario son específicos para el anticuerpo primario que ya está unido al antígeno,y por lo tanto el anticuerpo secundario se une al anticuerpo primario. Este método permite que más anticuerpos marcados con fluoróforos se unan a su objetivo, aumentando así la señal fluorescente durante la microscopía.

La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para la luz de microscopía con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en microbiológicos muestras. Esta técnica utiliza la especificidad de los anticuerpos frente a su antígeno para dirigir los tintes fluorescentes a dianas biomoléculas específicas dentro de una célula y, por lo tanto, permite la visualización de la distribución de la molécula diana a través de la muestra. La región específica que un anticuerpo reconoce en un antígeno se llama epítopo. [1]Se han realizado esfuerzos en el mapeo de epítopos ya que muchos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo y los niveles de unión entre anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden variar. [2] Además, la unión del fluoróforo al anticuerpo en sí no puede interferir con la especificidad inmunológica del anticuerpo o la capacidad de unión de su antígeno. [3] La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente utilizado de inmunotinción (usando anticuerpos para teñir proteínas) y es un ejemplo específico de inmunohistoquímica (el uso de la relación anticuerpo-antígeno en los tejidos). Esta técnica utiliza principalmente fluoróforos para visualizar la ubicación de los anticuerpos. [4]

La inmunofluorescencia se puede usar en secciones de tejido, líneas celulares cultivadas o células individuales, y se puede usar para analizar la distribución de proteínas , glucanos y pequeñas moléculas biológicas y no biológicas. Esta técnica incluso se puede utilizar para visualizar estructuras como filamentos de tamaño intermedio. [5] Si aún no se ha determinado la topología de una membrana celular, la inserción de epítopos en proteínas se puede utilizar junto con la inmunofluorescencia para determinar las estructuras. [6]La inmunofluorescencia también se puede utilizar como un método "semicuantitativo" para obtener información sobre los niveles y patrones de localización de la metilación del ADN, ya que es un método que requiere más tiempo que los métodos cuantitativos verdaderos y existe cierta subjetividad en el análisis de los niveles de metilación. [7] La inmunofluorescencia se puede usar en combinación con otros métodos de tinción fluorescente sin anticuerpos, por ejemplo, el uso de DAPI para marcar el ADN . Se pueden utilizar varios diseños de microscopios para el análisis de muestras de inmunofluorescencia; el más simple es el microscopio de epifluorescencia , y el microscopio confocal también se usa ampliamente. Varias superresolucionesTambién se pueden utilizar diseños de microscopios que son capaces de una resolución mucho mayor. [8]

Tipos [ editar ]

Microfotografía de un corte histológico de piel humana preparada para inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo anti-IgG. La piel es de un paciente con lupus eritematoso sistémico y muestra depósitos de IgG en dos lugares diferentes: el primero es un depósito en forma de banda a lo largo de la membrana basal epidérmica (la "prueba de banda de lupus" es positiva). El segundo está dentro de los núcleos de las células epidérmicas (anticuerpos antinucleares).

Preparación de fluorescencia [ editar ]

Para producir anticuerpos marcados con fluorocromo, se debe conjugar ("etiquetar") un fluorocromo con el anticuerpo. Asimismo, también se puede conjugar un antígeno al anticuerpo con una sonda fluorescente en una técnica llamada técnica de antígeno fluorescente. Los procedimientos de tinción pueden aplicarse tanto al antígeno fijado en el citoplasma como a los antígenos de la superficie celular de las células vivas, lo que se denomina "inmunofluorescencia de membrana". También es posible marcar el complemento del complejo anticuerpo-antígeno con una sonda fluorescente. Además del elemento al que se unen las sondas de fluorescencia, existen dos clases generales de técnicas de inmunofluorescencia: primaria y secundaria. Las siguientes descripciones se centrarán principalmente en estas clases en términos de anticuerpos conjugados. [3]

Hay dos clases de técnicas de inmunofluorescencia, primarias (o directas) y secundarias (o indirectas).

Principal (directo) [ editar ]

La inmunofluorescencia primaria (directa) utiliza un único anticuerpo primario, unido químicamente a un fluoróforo . El anticuerpo primario reconoce la molécula diana (antígeno) y se une a una región específica llamada epítopo. Esto se logra mediante un proceso que manipula la respuesta inmune del organismo con inmunidad adaptativa. El fluoróforo adjunto se puede detectar mediante microscopía fluorescente, que, dependiendo del mensajero utilizado, emitirá una longitud de onda de luz específica una vez excitado. [9] La inmunofluorescencia directa, aunque algo menos común, tiene ventajas notables sobre el procedimiento secundario (indirecto). La unión directa del mensajero al anticuerpo reduce el número de pasos del procedimiento, lo que ahorra tiempo y reduce la señal de fondo no específica. [10]Esto también limita la posibilidad de reactividad cruzada de anticuerpos y posibles errores a lo largo del proceso. Sin embargo, existen algunas desventajas en este método. Dado que el número de moléculas fluorescentes que pueden unirse al anticuerpo primario es limitado, la inmunofluorescencia directa es sustancialmente menos sensible que la inmunofluorescencia indirecta y puede dar como resultado falsos negativos. La inmunofluorescencia directa también requiere el uso de mucho más anticuerpo primario, que es extremadamente costoso, a veces llega a los $ 400.00 / mL.

Secundario (indirecto) [ editar ]

Tinción fluorescente para actina en el músculo liso de la piel.

La inmunofluorescencia secundaria (indirecta) utiliza dos anticuerpos; el primer anticuerpo (primario) sin marcar se une específicamente a la molécula diana, y el anticuerpo secundario, que transporta el fluoróforo, reconoce el anticuerpo primario y se une a él. Múltiples anticuerpos secundarios pueden unirse a un único anticuerpo primario. Esto proporciona amplificación de la señal al aumentar el número de moléculas de fluoróforo por antígeno. [10] Este protocolo es más complejo y requiere más tiempo que el protocolo primario (o directo) anterior, pero permite una mayor flexibilidad porque se pueden usar una variedad de anticuerpos secundarios y técnicas de detección diferentes para un anticuerpo primario dado. [10]

Este protocolo es posible porque un anticuerpo consta de dos partes, una región variable (que reconoce el antígeno) y una región constante (que constituye la estructura de la molécula de anticuerpo). Es importante darse cuenta de que esta división es artificial y en realidad la molécula de anticuerpo son cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Un investigador puede generar varios anticuerpos primarios que reconocen varios antígenos (tienen diferentes regiones variables), pero todos comparten la misma región constante. Por tanto, todos estos anticuerpos pueden ser reconocidos por un único anticuerpo secundario. Esto ahorra el costo de modificar los anticuerpos primarios para que transporten directamente un fluoróforo.

Típicamente, se generan diferentes anticuerpos primarios con diferentes regiones constantes al generar el anticuerpo en diferentes especies. Por ejemplo, un investigador puede crear anticuerpos primarios en una cabra que reconozcan varios antígenos y luego emplear anticuerpos secundarios de conejo acoplados a colorante que reconozcan la región constante del anticuerpo de cabra (anticuerpos "conejo anti-cabra"). El investigador puede entonces crear un segundo conjunto de anticuerpos primarios en un ratón que podría ser reconocido por un anticuerpo secundario "burro anti-ratón" separado. Esto permite la reutilización de los anticuerpos acoplados a colorantes difíciles de fabricar en múltiples experimentos.

Limitaciones [ editar ]

Como ocurre con la mayoría de las técnicas de fluorescencia, un problema importante de la inmunofluorescencia es el fotoblanqueo . La pérdida de actividad causada por el fotoblanqueo se puede controlar reduciendo o limitando la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, aumentando la concentración de fluoróforos o empleando fluoróforos más robustos que son menos propensos al blanqueamiento (p. Ej., Alexa Fluors , Seta Fluors o DyLight Fluors). Algunos problemas que pueden surgir de esta técnica incluyen autofluorescencia, fluorescencia específica indeseada extraña y fluorescencia inespecífica. La autofluorescencia incluye la fluorescencia emitida por la muestra de tejido o la propia célula. La fluorescencia específica no deseada extraña se produce cuando un antígeno objetivo es impuro y contiene contaminantes antigénicos. La fluorescencia inespecífica implica la pérdida de la especificidad de una sonda debido al fluoróforo, a una fijación incorrecta oa una muestra seca. [3]

La inmunofluorescencia solo se limita a las células fijadas (es decir, muertas) cuando las estructuras dentro de la célula deben visualizarse porque los anticuerpos no penetran en la membrana celular cuando reaccionan con marcadores fluorescentes. El material antigénico debe fijarse firmemente en el sitio de su localización natural dentro de la célula. [3] Los anticuerpos intactos también pueden ser demasiado grandes para teñir las células cancerosas in vivo . [11] Su tamaño da como resultado una penetración lenta del tumor y una vida media de circulación prolongada. Se han realizado investigaciones sobre el uso de diacuerpos para sortear esta limitación. [11]Las proteínas del sobrenadante o del exterior de la membrana celular pueden unirse a los anticuerpos; esto permite teñir las células vivas. Dependiendo del fijador que se esté utilizando, las proteínas de interés pueden reticularse y esto podría dar como resultado señales falsas positivas o falsas negativas debido a la unión no específica.

Un enfoque alternativo es usar proteínas recombinantes que contienen dominios de proteínas fluorescentes, por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP). El uso de tales proteínas "etiquetadas" permite la determinación de su localización en células vivas. Aunque esto parece ser una alternativa elegante a la inmunofluorescencia, las células deben ser transfectadas o transducidas con la etiqueta GFP y, como consecuencia, se convierten en organismos al menos S1 o superiores que requieren estándares de seguridad más estrictos en un laboratorio. Esta técnica implica alterar la información genética de las células. [12]

Avances [ editar ]

Muchas mejoras de este método se encuentran en la mejora de los microscopios fluorescentes y los fluoróforos. Los métodos de superresolución generalmente se refieren a la capacidad de un microscopio para producir una resolución por debajo del límite de Abbe (un límite impuesto a la luz debido a su longitud de onda). Este límite de difracción es de aproximadamente 200-300 nm en la dirección lateral y 500-700 nm en la dirección axial. Este límite es comparable o más grande que algunas estructuras en la célula y, en consecuencia, este límite impidió a los científicos determinar detalles en su estructura. [13] La superresolución en fluorescencia, más específicamente, se refiere a la capacidad de un microscopio para prevenir la fluorescencia simultánea de fluoróforos adyacentes espectralmente idénticos. [14]Este proceso agudiza eficazmente la función de dispersión puntual del microscopio. [13] Ejemplos de métodos de microscopio fluorescente de superresolución desarrollados recientemente incluyen microscopía de reducción de emisión estimulada (STED), microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM), microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM) y microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM). [15]

Ver también [ editar ]

  • Condiciones cutáneas con hallazgos de inmunofluorescencia
  • Inmunoquímica
  • Parcheo y tapado

Referencias [ editar ]

  1. ^ Mandrell, RE; Griffiss, JM; Macher, BA (1 de julio de 1988). "Los lipooligosacáridos (LOS) de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis tienen componentes que son inmunoquímicamente similares a los precursores de antígenos del grupo sanguíneo humano. Especificidad de secuencia de carbohidratos de los anticuerpos monoclonales de ratón que reconocen antígenos de reacción cruzada en LOS y eritrocitos humanos" . Revista de Medicina Experimental . 168 (1): 107–126. doi : 10.1084 / jem.168.1.107 . ISSN  0022-1007 . PMC  2188965 . PMID  2456365 .
  2. ↑ Ladner, Robert C. (1 de enero de 2007). "Mapeo de los epítopos de anticuerpos". Reseñas de Biotecnología e Ingeniería Genética . 24 (1): 1–30. CiteSeerX 10.1.1.536.6172 . doi : 10.1080 / 02648725.2007.10648092 . ISSN 0264-8725 .  
  3. ↑ a b c d Akiyoshi., Kawamura (1 de enero de 1983). Inmunofluorescencia en la ciencia médica: con 28 tab . Springer ua ISBN 978-3540124832. OCLC  643714056 .
  4. ^ "Inmunofluorescencia" . Protocolo en línea .
  5. ^ Franke, WW; Schmid, E .; Osborn, M .; Weber, K. (1 de octubre de 1978). "Diferentes filamentos de tamaño intermedio que se distinguen por microscopía de inmunofluorescencia" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 75 (10): 5034–5038. doi : 10.1073 / pnas.75.10.5034 . ISSN 0027-8424 . PMC 336257 . PMID 368806 .   
  6. ^ Wang, Honggang; Lee, Eun-Woo; Cai, Xiaokun; Ni, Zhanglin; Zhou, Lin; Mao, Qingcheng (30 de diciembre de 2008). "Topología de membrana de la proteína de resistencia al cáncer de mama humano (BCRP / ABCG2) determinada por inserción de epítopo e inmunofluorescencia" . Bioquímica . 47 (52): 13778-13787. doi : 10.1021 / bi801644v . ISSN 0006-2960 . PMC 2649121 . PMID 19063604 .   
  7. ^ Çelik, Selcen (01.01.2015). "Comprender la complejidad de la recuperación de antígenos de la metilación del ADN para la medición basada en inmunofluorescencia y un enfoque para desafiar". Revista de métodos inmunológicos . 416 : 1-16. doi : 10.1016 / j.jim.2014.11.011 . PMID 25435341 . 
  8. ^ "Método de inmunofluorescencia" . Davidson College.
  9. ^ "Métodos de tinción inmunohistoquímica" (PDF) . Guía de IHC (Sexta ed.). Dako Denmark A / S, una empresa de tecnologías de Agilent. 2013.
  10. ↑ a b c Fritschy J, Härtig W (2001). Inmunofluorescencia . eLS . doi : 10.1038 / npg.els.0001174 .
  11. ^ a b Sonn GA, Behesnilian AS, Jiang ZK, Zettlitz KA, Lepin EJ, Bentolila LA, Knowles SM, Lawrence D, Wu AM, Reiter RE (2016). "Cirugía guiada por imágenes fluorescentes con un diacuerpo de antígeno de células madre de próstata (PSCA) permite la resección dirigida de xenoinjertos de cáncer de próstata de ratón en tiempo real" . Investigación clínica del cáncer . 22 (6): 1403–12. doi : 10.1158 / 1078-0432.CCR-15-0503 . PMC 4794340 . PMID 26490315 .  
  12. ↑ Chalfie, Martin (1 de octubre de 1995). "Proteína verde fluorescente". Fotoquímica y Fotobiología . 62 (4): 651–656. doi : 10.1111 / j.1751-1097.1995.tb08712.x . ISSN 1751-1097 . 
  13. ^ a b Huang, Bo; Bates, Mark; Zhuang, Xiaowei (2 de junio de 2009). "Microscopía de fluorescencia de superresolución" . Revisión anual de bioquímica . 78 : 993–1016. doi : 10.1146 / annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776 . PMID 19489737 .  
  14. ^ 1959-, Diaspro, Alberto; van, Zandvoort, Marc AMJ (3 de noviembre de 2016). Imágenes de superresolución en biomedicina . ISBN 9781482244359. OCLC  960719686 .CS1 maint: nombres numéricos: lista de autores ( enlace )
  15. ^ Leung, Bonnie O .; Chou, Keng C. (1 de septiembre de 2011). "Revisión de microscopía de fluorescencia de superresolución para biología" . Espectroscopía aplicada . 65 (9): 967–980. doi : 10.1366 / 11-06398 . ISSN 0003-7028 . PMID 21929850 .  

Enlaces externos [ editar ]

  • Imágenes asociadas con enfermedades autoinmunes en la Universidad de Birmingham
  • Protocolo de tinción por inmunofluorescencia
  • Descripción general en Davidson College
  • Inmunofluorescencia en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
  • SynD: detección automática de sinapsis y neuritas en imágenes de inmunofluorescencia