El marcaje con inmunoold o tinción con inmunodorado (IGS) es una técnica de tinción utilizada en microscopía electrónica . [2] Esta técnica de tinción es equivalente a la técnica de inmunofluorescencia indirecta para luz visible. Las partículas de oro coloidal se unen con mayor frecuencia a anticuerpos secundarios que a su vez se unen a anticuerpos primarios diseñados para unirse a un antígeno específico u otro componente celular . El oro se utiliza por su alta densidad de electrones, que aumenta la dispersión de los electrones para producir "puntos oscuros" de alto contraste. [3]
Utilizado por primera vez en 1971, el marcaje inmunológico se ha aplicado tanto a la microscopía electrónica de transmisión como a la microscopía electrónica de barrido , así como a la microscopía de campo claro . La técnica de etiquetado se puede adaptar para distinguir varios objetos mediante el uso de partículas de oro de diferentes tamaños.
El etiquetado con inmunogold puede introducir artefactos, ya que las partículas de oro se encuentran a cierta distancia del objeto etiquetado y se requiere un corte muy fino durante la preparación de la muestra. [3]
Historia
El marcaje Immunogold fue utilizado por primera vez en 1971 por Faulk y Taylor para identificar los antígenos de Salmonella . [2] [4] Se aplicó por primera vez en microscopía electrónica de transmisión (TEM) y fue especialmente útil para resaltar proteínas que se encuentran en densidades bajas, como algunos antígenos de la superficie celular. [5] A medida que aumentaba la resolución de la microscopía electrónica de barrido (SEM), también lo hacía la necesidad de etiquetas del tamaño de nanopartículas, como el inmunogol. En 1975, Horisberger y colaboradores visualizaron con éxito nanopartículas de oro con un diámetro de menos de 30 nm [6] y esto pronto se convirtió en una técnica SEM establecida. [5]
Técnica
Primero, se corta una sección delgada de la muestra, a menudo usando un micrótomo . [7] A continuación, pueden tener lugar varias otras etapas de preparación de la muestra .
Luego, la muestra preparada se incuba con un anticuerpo específico diseñado para unirse a la molécula de interés. [3] A continuación, se agrega un anticuerpo secundario que tiene adheridas partículas de oro y se une al anticuerpo primario. El oro también se puede unir a la proteína A o la proteína G en lugar de un anticuerpo secundario, ya que estas proteínas se unen a las regiones Fc de IgG de mamíferos de una manera no específica. [6]
La partícula de oro densa en electrones ahora se puede ver bajo un microscopio electrónico como un punto negro, que marca indirectamente la molécula de interés. [3]
Etiquetar varios objetos
El marcaje con inmunogold se puede utilizar para visualizar más de un objetivo simultáneamente. Esto se puede lograr en microscopía electrónica utilizando dos partículas de oro de diferentes tamaños. [8] Una extensión de este método utilizó tres partículas de oro de diferentes tamaños para rastrear la localización de péptidos reguladores . [9] Un método más complejo de etiquetado de múltiples sitios implica etiquetar los lados opuestos de un sitio antigénico por separado, las partículas de oro inmunológico adheridas a ambos lados se pueden ver simultáneamente. [10]
Usos en microscopía de campo claro
Aunque el marcaje con inmunooro se usa típicamente para microscopía electrónica de transmisión, cuando el oro se 'realza con plata', se puede ver usando microscopía de campo claro . [11] El realce de plata aumenta el tamaño de las partículas, lo que también hace posible la microscopía electrónica de barrido. Para producir las partículas de oro mejoradas con plata, las partículas de oro coloidal se colocan en una solución de mejora ácida que contiene iones de plata . Las partículas de oro actúan luego como un sitio de nucleación y la plata se deposita sobre la partícula. Un ejemplo de la aplicación del etiquetado inmunológico con plata potenciada (IGSS) fue la identificación del patógeno Erwinia amylovora . [11]
Limitaciones
Una limitación inherente a la técnica de inmunogold es que la partícula de oro está a unos 15-30 nm de distancia del sitio al que se une el anticuerpo primario [5] (cuando se utiliza una estrategia de marcaje de anticuerpos primarios y secundarios ). Por lo tanto, la ubicación precisa de la molécula objetivo no se puede calcular con precisión. Se pueden crear partículas de oro con un diámetro de 1 nm (o menos), pero luego se observa otra limitación: en estos tamaños, la etiqueta dorada se vuelve difícil de distinguir de la estructura del tejido. [2] [5]
Se requieren secciones delgadas para el etiquetado inmunológico y estas pueden producir imágenes engañosas; un corte delgado de un componente celular puede no dar una visión precisa de su estructura tridimensional . Por ejemplo, un microtúbulo puede aparecer como un "pico" según el plano en el que se produjo la sección. Para superar esta limitación, se pueden tomar secciones en serie, que luego se pueden compilar en una imagen tridimensional . [3]
Una limitación adicional es que los anticuerpos y las partículas de oro no pueden penetrar la resina utilizada para incrustar las muestras para la obtención de imágenes. Por lo tanto, solo las moléculas accesibles pueden ser identificadas y visualizadas. El etiquetado antes de incrustar la muestra puede reducir el impacto negativo de esta limitación. [3]
Ver también
- Inmunohistoquímica
Referencias
- ^ Iborra FJ, Kimura H, Cook PR (2004). "La organización funcional de los genomas mitocondriales en células humanas" . BMC Biol. 2 : 9. doi : 10.1186 / 1741-7007-2-9 . PMC 425603 . PMID 15157274 .
- ^ a b c "Etiquetado inmunológico en microscopía electrónica de barrido" . Archivado desde el original el 6 de febrero de 2014 . Consultado el 8 de julio de 2010 .
- ^ a b c d e f Alberts, Bruce; et al. (2008). Biología molecular de la célula (5ª ed.). Nueva York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4106-2.
- ^ Faulk WP, Taylor GM (noviembre de 1971). "Un método inmunocoloide para el microscopio electrónico". Inmunoquímica . 8 (11): 1081–3. doi : 10.1016 / 0019-2791 (71) 90496-4 . PMID 4110101 .
- ^ a b c d Hermann R, Walther P, Müller M (1996). "Etiquetado inmunológico en microscopía electrónica de barrido". Histoquímica y Biología Celular . 106 (1): 31–39. doi : 10.1007 / BF02473200 . PMID 8858365 .
- ^ a b Roth J, Bendayan M, Orci L (diciembre de 1978). "Localización ultraestructural de antígenos intracelulares mediante el uso de complejo proteína A-oro" . J. Histochem. Cytochem . 26 (12): 1074–81. doi : 10.1177 / 26.12.366014 . PMID 366014 . Archivado desde el original el 7 de septiembre de 2008 . Consultado el 8 de julio de 2010 .
- ^ Porter, K; Blum, J (1953). "Un estudio en Microtomía para Microscopía Electrónica". El registro anatómico . 117 (4): 685–710. doi : 10.1002 / ar.1091170403 . PMID 13124776 .
- ^ Roth J, Binder M (marzo de 1978). "Oro coloidal, ferritina y peroxidasa como marcadores para técnicas de lectina de doble marcaje microscópico electrónico" . J. Histochem. Cytochem . 26 (3): 163–9. doi : 10.1177 / 26.3.632554 . PMID 632554 . Consultado el 18 de julio de 2010 .[ enlace muerto permanente ]
- ^ Tapia FJ, Varndell IM, Probert L, De Mey J, Polak JM (julio de 1983). "Método de tinción de doble inmunogold para la localización ultraestructural simultánea de péptidos reguladores" . J. Histochem. Cytochem . 31 (7): 977–81. doi : 10.1177 / 31.7.6189888 . PMID 6189888 . Consultado el 18 de julio de 2010 .[ enlace muerto permanente ]
- ^ Bendayan M (enero de 1982). "Doble marcaje inmunocitoquímico aplicando la técnica de la proteína A-oro" . J. Histochem. Cytochem . 30 (1): 81–5. doi : 10.1177 / 30.1.6172469 . PMID 6172469 . Consultado el 18 de julio de 2010 .[ enlace muerto permanente ]
- ^ a b Van Laere O, De Wael L, De Mey J (1985). "Inmuno tinción de oro (IGS) y tinción de inmuno oro y plata (IGSS) para la identificación de la bacteria patógena de plantas Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al". Histoquímica . 83 (5): 397–9. doi : 10.1007 / BF00509198 . PMID 2416717 .