Microscopio optico

Microscopio que usa luz visible.

Un microscopio óptico moderno con una bombilla de mercurio para microscopía de fluorescencia . El microscopio tiene una cámara digital que está conectada a una computadora .

El microscopio óptico , también conocido como microscopio óptico , es un tipo de microscopio que comúnmente usa luz visible y un sistema de lentes para generar imágenes ampliadas de objetos pequeños. Los microscopios ópticos son el diseño de microscopio más antiguo y posiblemente se inventaron en su forma compuesta actual en el siglo XVII. Los microscopios ópticos básicos pueden ser muy simples, aunque muchos diseños complejos tienen como objetivo mejorar la resolución y el contraste de la muestra .

El objeto se coloca en un escenario y se puede ver directamente a través de uno o dos oculares en el microscopio. En los microscopios de alta potencia, ambos oculares suelen mostrar la misma imagen, pero con un microscopio estereoscópico , se utilizan imágenes ligeramente diferentes para crear un efecto 3-D. Normalmente se utiliza una cámara para capturar la imagen ( micrografía ).

La muestra se puede iluminar de diversas formas. Los objetos transparentes se pueden iluminar desde abajo y los objetos sólidos se pueden iluminar con luz que entra ( campo claro ) o alrededor ( campo oscuro ) de la lente del objetivo. Se puede usar luz polarizada para determinar la orientación del cristal de objetos metálicos. Las imágenes de contraste de fase se pueden utilizar para aumentar el contraste de la imagen resaltando pequeños detalles de diferente índice de refracción.

Por lo general, se proporciona una gama de lentes de objetivo con diferentes aumentos montados en una torreta, lo que permite que se giren en su lugar y brinden la capacidad de hacer zoom. El poder de aumento máximo de los microscopios ópticos se limita típicamente a alrededor de 1000x debido al poder de resolución limitado de la luz visible. El aumento de un microscopio óptico compuesto es el producto del aumento del ocular (digamos 10x) y la lente del objetivo (digamos 100x), para dar un aumento total de 1,000 ×. Los entornos modificados, como el uso de aceite o luz ultravioleta, pueden aumentar el aumento.

Las alternativas a la microscopía óptica que no utilizan luz visible incluyen la microscopía electrónica de barrido y la microscopía electrónica de transmisión y la microscopía de sonda de barrido y, como resultado, pueden lograr aumentos mucho mayores.

Tipos

Diagrama de un microscopio simple

Hay dos tipos básicos de microscopios ópticos: microscopios simples y microscopios compuestos. Un microscopio simple utiliza la potencia óptica de una sola lente o un grupo de lentes para la ampliación. Un microscopio compuesto usa un sistema de lentes (un juego agranda la imagen producida por otro) para lograr un aumento mucho mayor de un objeto. La gran mayoría de los microscopios de investigación modernos son microscopios compuestos, mientras que algunos microscopios digitales comerciales más económicos son simples microscopios de lente única. Los microscopios compuestos se pueden dividir además en una variedad de otros tipos de microscopios que difieren en sus configuraciones ópticas, costo y propósitos previstos.

Microscopio simple

Un microscopio simple usa una lente o un juego de lentes para agrandar un objeto a través del aumento angular solamente, dando al espectador una imagen virtual ampliada y erecta . ^{[1] [2]} El uso de una sola lente convexa o grupos de lentes se encuentra en dispositivos de aumento simples como lupas , lupas y oculares para telescopios y microscopios.

Microscopio compuesto

Diagrama de un microscopio compuesto

Un microscopio compuesto usa una lente cerca del objeto que se está viendo para recolectar luz (llamada lente del objetivo ) que enfoca una imagen real del objeto dentro del microscopio (imagen 1). Luego, esa imagen se amplía con una segunda lente o grupo de lentes (llamado ocular ) que le da al espectador una imagen virtual invertida ampliada del objeto (imagen 2). ^[3] El uso de una combinación de objetivo / ocular compuesto permite un aumento mucho mayor. Los microscopios compuestos comunes a menudo cuentan con lentes de objetivo intercambiables, lo que permite al usuario ajustar rápidamente el aumento. ^[3] Un microscopio compuesto también permite configuraciones de iluminación más avanzadas, como el contraste de fase .

Otras variantes de microscopio

Existen muchas variantes del diseño de microscopio óptico compuesto para fines especializados. Algunas de estas son diferencias de diseño físico que permiten la especialización para ciertos propósitos:

• Microscopio estereoscópico , un microscopio de baja potencia que proporciona una vista estereoscópica de la muestra, comúnmente utilizado para la disección.
• Microscopio de comparación , que tiene dos caminos de luz separados que permiten la comparación directa de dos muestras a través de una imagen en cada ojo.
• Microscopio invertido , para estudiar muestras desde abajo; útil para cultivos celulares en líquido o para metalografía.
• Microscopio de inspección de conectores de fibra óptica, diseñado para la inspección del extremo del conector
• Microscopio móvil , para el estudio de muestras de alta resolución óptica .

Otras variantes de microscopios están diseñadas para diferentes técnicas de iluminación:

• Microscopio petrográfico , cuyo diseño suele incluir un filtro polarizador, platina giratoria y placa de yeso para facilitar el estudio de minerales u otros materiales cristalinos cuyas propiedades ópticas pueden variar con la orientación.
• Microscopio de polarización , similar al microscopio petrográfico.
• Microscopio de contraste de fase , que aplica el método de iluminación de contraste de fase.
• Microscopio de epifluorescencia , diseñado para el análisis de muestras que incluyen fluoróforos.
• Microscopio confocal , una variante ampliamente utilizada de iluminación epifluorescente que utiliza un láser de barrido para iluminar una muestra de fluorescencia.
• Microscopio de dos fotones , utilizado para obtener imágenes de fluorescencia más profundas en medios de dispersión y reducir el fotoblanqueo, especialmente en muestras vivas.
• Microscopio para estudiantes: un microscopio a menudo de baja potencia con controles simplificados y, a veces, ópticas de baja calidad diseñado para uso escolar o como instrumento de iniciación para niños. ^[4]
• Ultramicroscopio , un microscopio de luz adaptado que utiliza la dispersión de luz para permitir la visualización de partículas diminutas cuyo diámetro está por debajo o cerca de la longitud de onda de la luz visible (alrededor de 500 nanómetros); en su mayoría obsoletos desde el advenimiento de los microscopios electrónicos
• El microscopio Raman con punta mejorada es una variante del microscopio óptico basado en espectroscopía Raman mejorada con punta , sin límites de resolución tradicionales basados ​​en la longitud de onda. ^{[5] [6]} Este microscopio se realizó principalmente en las plataformas del microscopio de sonda de barrido utilizando todas las herramientas ópticas.

Microscopio digital

Un microscopio USB en miniatura .

Artículo principal: microscopio digital

Un microscopio digital es un microscopio equipado con una cámara digital que permite la observación de una muestra a través de una computadora . Los microscopios también pueden controlarse total o parcialmente por computadora con varios niveles de automatización. La microscopía digital permite un mayor análisis de una imagen de microscopio, por ejemplo, mediciones de distancias y áreas y cuantificación de una tinción fluorescente o histológica .

Los microscopios digitales de baja potencia, microscopios USB , también están disponibles comercialmente. Se trata esencialmente de cámaras web con un objetivo macro de alta potencia y, por lo general, no utilizan transiluminación . La cámara se conecta directamente al puerto USB de una computadora para que las imágenes se muestren directamente en el monitor. Ofrecen aumentos modestos (hasta aproximadamente 200 ×) sin la necesidad de usar oculares y a un costo muy bajo. La iluminación de alta potencia generalmente es proporcionada por una fuente de LED o fuentes adyacentes a la lente de la cámara.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar daños en muestras biológicas vulnerables está disponible utilizando cámaras digitales sensibles con conteo de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporcione pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de dañar las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de imágenes fantasma a la microscopía con escasos fotones, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales se correlaciona espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para obtener imágenes eficientes mediante una cámara de conteo de fotones. ^[7]

Historia

Ver también: Historia de la óptica y Cronología de la tecnología de microscopios

Invención

Los primeros microscopios fueron lupas de una sola lente con aumento limitado que se remontan al menos al uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII. ^[8]

Los microscopios compuestos aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620 ^{[9] [10],} incluido uno demostrado por Cornelis Drebbel en Londres (alrededor de 1621) y uno exhibido en Roma en 1624. ^{[11] [12]}

Se desconoce el inventor real del microscopio compuesto, aunque se han realizado muchas afirmaciones a lo largo de los años. Estos incluyen una afirmación 35 ^[13] años después de que aparecieran por el fabricante de gafas holandés Johannes Zachariassen que su padre, Zacharias Janssen , inventó el microscopio compuesto y / o el telescopio ya en 1590. Johannes '(algunos afirman dudoso) ^{[14] [15] [16] El} testimonio lleva la fecha de la invención tan atrás que Zacharias habría sido un niño en ese momento, lo que lleva a la especulación de que, para que la afirmación de Johannes sea cierta, el microscopio compuesto debería haber sido inventado por Johannes. abuelo, Hans Martens. ^[17] Otra afirmación es que el competidor de Janssen,Hans Lippershey (quien solicitó la primera patente de telescopio en 1608) también inventó el microscopio compuesto. ^[18] Otros historiadores señalan al innovador holandés Cornelis Drebbel con su microscopio compuesto de 1621. ^{[11] [12]}

Galileo Galilei también se cita a veces como inventor del microscopio compuesto. Después de 1610, descubrió que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños, como moscas, de cerca ^[19] y / o podía mirar a través del extremo equivocado al revés para ampliar objetos pequeños. ^[20] El único inconveniente fue que su telescopio de 2 pies de largo tuvo que extenderse hasta 6 pies para ver objetos tan cercanos. ^[21] Después de ver el microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, Galileo construyó su propia versión mejorada. ^{[11] [12]} En 1625, Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei.en 1624 ^[22] (Galileo lo había llamado el " occhiolino " u " ojo pequeño "). Faber acuñó el nombre de las palabras griegas μικρόν (micron) que significa "pequeño", y σκοπεῖν (skopein) que significa "mirar", un nombre destinado a ser análogo a " telescopio ", otra palabra acuñada por los linceanos. ^[23]

Christiaan Huygens , otro holandés, desarrolló un sistema ocular simple de 2 lentes a fines del siglo XVII que se corrigió acromáticamente y, por lo tanto, fue un gran paso adelante en el desarrollo del microscopio. El ocular de Huygens todavía se está produciendo hasta el día de hoy, pero tiene un tamaño de campo pequeño y otras desventajas menores.

Popularización

La imagen publicada más antigua que se sabe que se hizo con un microscopio: abejas de Francesco Stelluti , 1630 ^[24]

A Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) se le atribuye el mérito de haber llamado la atención de los biólogos sobre el microscopio, a pesar de que ya se estaban produciendo lentes de aumento simples en el siglo XVI. Los microscopios caseros de Van Leeuwenhoek eran microscopios simples, con una única lente muy pequeña pero fuerte. Eran incómodos en su uso, pero permitieron a van Leeuwenhoek ver imágenes detalladas. Se necesitaron aproximadamente 150 años de desarrollo óptico antes de que el microscopio compuesto pudiera proporcionar la misma calidad de imagen que los microscopios simples de van Leeuwenhoek, debido a las dificultades para configurar múltiples lentes. En la década de 1850, John Leonard Riddell , profesor de química en la Universidad de Tulane, inventó el primer microscopio binocular práctico mientras realizaba una de las primeras y más extensas investigaciones microscópicas estadounidenses sobre el cólera . ^{[25] [26]}

Técnicas de iluminación

Si bien la tecnología y la óptica básicas del microscopio han estado disponibles durante más de 400 años, es mucho más recientemente que se desarrollaron técnicas de iluminación de muestras para generar imágenes de alta calidad que se ven hoy en día.

En agosto de 1893, August Köhler desarrolló la iluminación Köhler . Este método de iluminación de muestra da lugar a una iluminación extremadamente uniforme y supera muchas limitaciones de las técnicas más antiguas de iluminación de muestra. Antes del desarrollo de la iluminación de Köhler, la imagen de la fuente de luz, por ejemplo un filamento de bombilla , siempre era visible en la imagen de la muestra.

El Premio Nobel de Física fue otorgado al físico holandés Frits Zernike en 1953 por su desarrollo de la iluminación de contraste de fase que permite obtener imágenes de muestras transparentes. Mediante el uso de interferencia en lugar de absorción de luz , se pueden obtener imágenes de muestras extremadamente transparentes, como células de mamíferos vivos , sin tener que utilizar técnicas de tinción. Solo dos años después, en 1955, Georges Nomarski publicó la teoría de la microscopía de contraste de interferencia diferencial , otra técnica de imagen basada en interferencias .

Microscopía de fluorescencia

La microscopía biológica moderna depende en gran medida del desarrollo de sondas fluorescentes para estructuras específicas dentro de una célula. En contraste con la microscopía de luz transiluminada normal, en la microscopía de fluorescencia la muestra se ilumina a través de la lente del objetivo con un conjunto estrecho de longitudes de onda de luz. Esta luz interactúa con los fluoróforos en la muestra que luego emiten luz de una longitud de onda más larga . Es esta luz emitida la que forma la imagen.

Desde mediados del siglo XX , se han utilizado tinciones químicas fluorescentes, como DAPI, que se une al ADN , para marcar estructuras específicas dentro de la célula. Los desarrollos más recientes incluyen inmunofluorescencia , que usa anticuerpos marcados con fluorescencia para reconocer proteínas específicas dentro de una muestra, y proteínas fluorescentes como GFP que una célula viva puede expresar haciéndola fluorescente.

Componentes

Elementos básicos del microscopio de transmisión óptica (década de 1990)

Todos los microscopios ópticos modernos diseñados para ver muestras mediante luz transmitida comparten los mismos componentes básicos de la trayectoria de la luz. Además, la gran mayoría de microscopios tienen los mismos componentes 'estructurales' ^[27] (numerados a continuación según la imagen de la derecha):

• Ocular (lente ocular) (1)
• Torreta de objetivo, revólver o pieza de nariz giratoria (para sostener múltiples lentes de objetivo) (2)
• Lentes de objetivo (3)
• Perillas de enfoque (para mover el escenario)
  • Ajuste grueso (4)
  • Ajuste fino (5)
• Escenario (para sujetar la muestra) (6)
• Fuente de luz (una luz o un espejo ) (7)
• Diafragma y condensador (8)
• Etapa mecánica (9)

Ocular (lente ocular)

Artículo principal: ocular

El ocular , o lente ocular, es un cilindro que contiene dos o más lentes; su función es enfocar la imagen para el ojo. El ocular se inserta en el extremo superior del tubo del cuerpo. Los oculares son intercambiables y se pueden insertar muchos oculares diferentes con diferentes grados de aumento. Los valores de aumento típicos para los oculares incluyen 5 ×, 10 × (el más común), 15 × y 20 ×. En algunos microscopios de alto rendimiento, la configuración óptica de la lente del objetivo y el ocular se combinan para ofrecer el mejor rendimiento óptico posible. Esto ocurre más comúnmente con objetivos apocromáticos .

Torreta de objetivo (revólver o pieza de nariz giratoria)

La torreta de objetivo, el revólver o el morro giratorio es la parte que sostiene el juego de lentes de objetivo. Permite al usuario cambiar entre lentes de objetivo.

Lente objetivo

Artículo principal: Objetivo (óptica)

En el extremo inferior de un microscopio óptico compuesto típico, hay una o más lentes de objetivo que recogen la luz de la muestra. El objetivo suele estar en una carcasa de cilindro que contiene una lente compuesta de vidrio de uno o varios elementos. Normalmente, habrá alrededor de tres lentes de objetivo atornillados en una pieza de nariz circular que se puede girar para seleccionar la lente de objetivo requerida. Estos arreglos están diseñados para ser parafocales , lo que significa que cuando se cambia de una lente a otra en un microscopio, la muestra permanece enfocada . Los objetivos de microscopio se caracterizan por dos parámetros, a saber, aumento y apertura numérica.. El primero varía típicamente de 5 × a 100 × mientras que el segundo varía de 0,14 a 0,7, correspondientes a distancias focales de aproximadamente 40 a 2 mm, respectivamente. Los objetivos con mayores aumentos normalmente tienen una mayor apertura numérica y una menor profundidad de campo en la imagen resultante. Algunos objetivos de alto rendimiento pueden requerir oculares combinados para ofrecer el mejor rendimiento óptico.

Objetivo de inmersión en aceite

Dos lentes de objetivo de microscopio de inmersión en aceite Leica : 100 × (izquierda) y 40 × (derecha)

Artículo principal: inmersión en aceite

Algunos microscopios utilizan objetivos de inmersión en aceite u objetivos de inmersión en agua para obtener una mayor resolución a gran aumento. Estos se utilizan con material de coincidencia de índices , como aceite de inmersión o agua, y un cubreobjetos a juego entre la lente del objetivo y la muestra. El índice de refracción del material de coincidencia de índices es más alto que el aire, lo que permite que la lente del objetivo tenga una apertura numérica mayor (mayor que 1) para que la luz se transmita desde la muestra a la cara exterior de la lente del objetivo con una refracción mínima. Se pueden lograr aperturas numéricas tan altas como 1.6. ^[28]La apertura numérica más grande permite la recolección de más luz, lo que hace posible la observación detallada de detalles más pequeños. Una lente de inmersión en aceite generalmente tiene un aumento de 40 a 100 ×.

Perillas de enfoque

Las perillas de ajuste mueven el escenario hacia arriba y hacia abajo con un ajuste separado para un enfoque grueso y fino. Los mismos controles permiten que el microscopio se ajuste a muestras de diferente grosor. En diseños más antiguos de microscopios, las ruedas de ajuste de enfoque mueven el tubo del microscopio hacia arriba o hacia abajo en relación con el soporte y tenían una platina fija.

Marco

Todo el conjunto óptico está tradicionalmente unido a un brazo rígido, que a su vez está unido a un robusto pie en forma de U para proporcionar la rigidez necesaria. El ángulo del brazo puede ser ajustable para permitir que se ajuste el ángulo de visión.

El marco proporciona un punto de montaje para varios controles de microscopio. Normalmente, esto incluirá controles para el enfoque, por lo general una rueda moleteada grande para ajustar el enfoque grueso, junto con una rueda moleteada más pequeña para controlar el enfoque fino. Otras características pueden ser controles de lámpara y / o controles para ajustar el condensador.

Etapa

El escenario es una plataforma debajo de la lente del objetivo que sostiene la muestra que se está viendo. En el centro del escenario hay un agujero a través del cual pasa la luz para iluminar la muestra. El escenario suele tener brazos para sujetar portaobjetos (placas de vidrio rectangulares con dimensiones típicas de 25 × 75 mm, sobre las que se monta la muestra).

Con aumentos superiores a 100 ×, mover una diapositiva a mano no es práctico. Una platina mecánica, típica de los microscopios de precio medio y alto, permite pequeños movimientos del portaobjetos mediante perillas de control que reposicionan la muestra / portaobjetos como se desee. Si un microscopio no tenía originalmente una platina mecánica, es posible que se le agregue una.

Todas las etapas se mueven hacia arriba y hacia abajo para enfocarse. Con una platina mecánica, las diapositivas se mueven sobre dos ejes horizontales para colocar la muestra y examinar los detalles de la muestra.

El enfoque comienza con un aumento menor para que el usuario centre la muestra en el escenario. El cambio a un aumento mayor requiere que la platina se mueva más alto verticalmente para volver a enfocar con el aumento mayor y también puede requerir un ligero ajuste horizontal de la posición de la muestra. Los ajustes de posición de la muestra horizontal son la razón para tener una platina mecánica.

Debido a la dificultad de preparar muestras y montarlas en diapositivas, para los niños es mejor comenzar con diapositivas preparadas que estén centradas y enfocadas fácilmente independientemente del nivel de enfoque utilizado.

Fuente de luz

Se pueden utilizar muchas fuentes de luz. En su forma más simple, la luz del día se dirige a través de un espejo . La mayoría de los microscopios, sin embargo, tienen su propia fuente de luz ajustable y controlable, a menudo una lámpara halógena , aunque la iluminación con LED y láseres se está convirtiendo en una provisión más común. La iluminación de Köhler se proporciona a menudo en instrumentos más caros.

Condensador

El condensador es una lente diseñada para enfocar la luz de la fuente de iluminación sobre la muestra. El condensador también puede incluir otras características, como un diafragma y / o filtros, para gestionar la calidad e intensidad de la iluminación. Para técnicas de iluminación como campo oscuro , contraste de fase y microscopía de contraste de interferencia diferencial , los componentes ópticos adicionales deben alinearse con precisión en la trayectoria de la luz.

Ampliación

La potencia o aumento real de un microscopio óptico compuesto es el producto de las potencias del ocular ( ocular ) y la lente del objetivo. Los aumentos normales máximos del ocular y el objetivo son 10 × y 100 × respectivamente, lo que da un aumento final de 1000 ×.

Ampliación y micrografías

Cuando se utiliza una cámara para capturar una micrografía, el aumento efectivo de la imagen debe tener en cuenta el tamaño de la imagen. Esto es independiente de si se trata de una copia impresa de un negativo de película o de si se muestra digitalmente en la pantalla de una computadora .

En el caso de las cámaras de película fotográfica, el cálculo es sencillo; el aumento final es el producto de: el aumento de la lente del objetivo, el aumento de la óptica de la cámara y el factor de aumento de la impresión de la película en relación con el negativo. Un valor típico del factor de ampliación es de alrededor de 5 × (para el caso de una película de 35 mm y una impresión de 15 × 10 cm (6 × 4 pulgadas)).

En el caso de las cámaras digitales, es necesario conocer el tamaño de los píxeles en el detector CMOS o CCD y el tamaño de los píxeles en la pantalla. A continuación, se puede calcular el factor de ampliación del detector a los píxeles en la pantalla. Al igual que con una cámara de película, el aumento final es el producto de: el aumento de la lente del objetivo, el aumento de la óptica de la cámara y el factor de aumento.

Operación

Agente de la Oficina de Operaciones de Campo de la CBP de EE. UU. Que verifica la autenticidad de un documento de viaje en un aeropuerto internacional utilizando un microscopio estereoscópico

Técnicas de iluminación

Artículo principal: Microscopía

Hay muchas técnicas disponibles que modifican la trayectoria de la luz para generar una imagen de contraste mejorada a partir de una muestra. Las principales técnicas para generar un mayor contraste a partir de la muestra incluyen luz de polarización cruzada , campo oscuro , contraste de fase e iluminación de contraste de interferencia diferencial . Una técnica reciente ( Sarfus ) combina luz de polarización cruzada y diapositivas específicas con contraste para la visualización de muestras nanométricas.

• Cuatro ejemplos de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú . 1,559 μm / píxel.
• Iluminación de campo brillante , el contraste de la muestra proviene de la absorbancia de luz en la muestra.

• Iluminación de luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.

• Iluminación de campo oscuro , el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.

• Iluminación de contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de luz a través de la muestra.

Otras técnicas

Los microscopios modernos permiten algo más que la simple observación de la imagen de luz transmitida de una muestra; Hay muchas técnicas que se pueden utilizar para extraer otros tipos de datos. La mayoría de estos requieren equipo adicional además de un microscopio compuesto básico.

• Iluminación de luz reflejada o incidente (para análisis de estructuras de superficie)
• Microscopía de fluorescencia, ambos:

• Microscopía de epifluorescencia
• Microscopia confocal

• Microspectroscopia (donde se integra un espectrofotómetro UV-visible con un microscopio óptico)
• Microscopía ultravioleta
• Microscopía de infrarrojo cercano
• Microscopía de transmisión múltiple ^[29] para mejorar el contraste y reducir las aberraciones.
• Automatización (para escaneo automático de una muestra grande o captura de imágenes)

Aplicaciones

Una imagen de 40 aumentos de células en una prueba de frotis médica tomada a través de un microscopio óptico utilizando una técnica de montaje en húmedo , colocando la muestra en un portaobjetos de vidrio y mezclándola con una solución salina.

La microscopía óptica se utiliza ampliamente en microelectrónica, nanofísica, biotecnología, investigación farmacéutica, mineralogía y microbiología. ^[30]

La microscopía óptica se utiliza para el diagnóstico médico , el campo se denomina histopatología cuando se trata de tejidos, o en pruebas de frotis en células libres o fragmentos de tejido.

En el uso industrial, los microscopios binoculares son comunes. Además de las aplicaciones que necesitan una percepción de profundidad real , el uso de oculares dobles reduce la fatiga visual asociada con las largas jornadas laborales en una estación de microscopía. En determinadas aplicaciones, los microscopios de gran distancia de trabajo o de foco largo ^[31] son beneficiosos. Es posible que sea necesario examinar un artículo detrás de una ventana , o los sujetos industriales pueden ser un peligro para el objetivo. Tales ópticas se parecen a los telescopios con capacidades de enfoque cercano. ^{[32] [33]}

Los microscopios de medición se utilizan para mediciones de precisión. Hay dos tipos básicos. Uno tiene una retícula graduada para permitir medir distancias en el plano focal. ^[34] El otro tipo (y más antiguo) tiene un retículo simple y un mecanismo micrométrico para mover al sujeto en relación con el microscopio. ^[35]

Los microscopios portátiles muy pequeños han encontrado cierto uso en lugares donde un microscopio de laboratorio sería una carga. ^[36]

Limitaciones

El límite de difracción grabado en piedra en un monumento a Ernst Abbe .

Con aumentos muy altos con luz transmitida, los objetos puntuales se ven como discos borrosos rodeados de anillos de difracción . Estos se denominan discos Airy . El poder de resolución de un microscopio se toma como la capacidad de distinguir entre dos discos Airy estrechamente espaciados (o, en otras palabras, la capacidad del microscopio para revelar detalles estructurales adyacentes como distintos y separados). Son estos impactos de la difracción los que limitan la capacidad de resolver detalles finos. El alcance y la magnitud de los patrones de difracción se ven afectados por la longitud de onda de la luz (λ), los materiales refractivos utilizados para fabricar la lente del objetivo y la apertura numérica.(NA) de la lente del objetivo. Por lo tanto, existe un límite finito más allá del cual es imposible resolver puntos separados en el campo objetivo, conocido como límite de difracción . Suponiendo que las aberraciones ópticas en toda la configuración óptica son insignificantes, la resolución d , se puede establecer como:

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2NA}}}$

Por lo general, se asume una longitud de onda de 550 nm, que corresponde a la luz verde . Con aire como medio externo, el NA práctico más alto es 0,95 y con aceite hasta 1,5. En la práctica, el valor más bajo de d que se puede obtener con lentes convencionales es de aproximadamente 200 nm. Un nuevo tipo de lente que usa dispersión múltiple de luz permitió mejorar la resolución por debajo de 100 nm. ^[37]

Superando el límite de resolución

Hay varias técnicas disponibles para alcanzar resoluciones superiores al límite de luz transmitida descrito anteriormente. Las técnicas holográficas, descritas por Courjon y Bulabois en 1979, también son capaces de romper este límite de resolución, aunque la resolución fue restringida en su análisis experimental. ^[38]

Utilizando muestras fluorescentes se encuentran disponibles más técnicas. Los ejemplos incluyen Vertico SMI , microscopía óptica de barrido de campo cercano que utiliza ondas evanescentes y reducción de emisión estimulada . En 2005, se describió como herramienta didáctica un microscopio capaz de detectar una sola molécula. ^[39]

A pesar de los importantes avances de la última década, las técnicas para superar el límite de difracción siguen siendo limitadas y especializadas.

Si bien la mayoría de las técnicas se centran en aumentos en la resolución lateral, también existen algunas técnicas que tienen como objetivo permitir el análisis de muestras extremadamente delgadas. Por ejemplo, los métodos sarfus colocan la muestra delgada sobre una superficie que realza el contraste y, por lo tanto, permite visualizar directamente películas tan delgadas como de 0,3 nanómetros.

El 8 de octubre de 2014, se otorgó el Premio Nobel de Química a Eric Betzig , William Moerner y Stefan Hell por el desarrollo de microscopía de fluorescencia superesuelta . ^{[40] [41]}

Iluminación estructurada SMI

SMI (microscopía de iluminación modulada espacialmente) es un proceso óptico de luz de la denominada ingeniería de función de dispersión de puntos (PSF). Estos son procesos que modifican el PSF de un microscopio de una manera adecuada para aumentar la resolución óptica, para maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes que son pequeños en relación con la longitud de onda de la luz de iluminación, o para extraer otros parámetros estructurales en el rango nanométrico. ^{[42] [43]}

Microscopía de localización SPDMphymod

Microscopía 3D de súper resolución de doble color con Her2 y Her3 en células mamarias, colorantes estándar: Alexa 488, Alexa 568 LIMON

SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), la tecnología básica de microscopía de localización es un proceso óptico de luz de microscopía de fluorescencia que permite mediciones de posición, distancia y ángulo en partículas "ópticamente aisladas" (por ejemplo, moléculas) muy por debajo del límite teórico de resolución para microscopía óptica. "Ópticamente aislado" significa que en un momento dado, solo se registra una única partícula / molécula dentro de una región de un tamaño determinado por resolución óptica convencional (típicamente aproximadamente 200–250 nm de diámetro ). Esto es posible cuando las moléculas dentro de dicha región tienen marcadores espectrales diferentes (por ejemplo, colores diferentes u otras diferencias utilizables en la emisión de luzde diferentes partículas). ^{[44] [45] [46] [47]}

Muchos tintes fluorescentes estándar como GFP , tintes Alexa, tintes Atto, Cy2 / Cy3 y moléculas de fluoresceína se pueden usar para microscopía de localización, siempre que estén presentes ciertas condiciones fotofísicas. Usando esta tecnología llamada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), una sola longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la obtención de nano imágenes. ^[48]

Microscopía de súper resolución 3D

La microscopía de súper resolución 3D con tintes fluorescentes estándar se puede lograr mediante la combinación de microscopía de localización para tintes fluorescentes estándar SPDMphymod e iluminación estructurada SMI. ^[49]

STED

Imagen de microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) de filamentos de actina dentro de una célula.

El agotamiento de las emisiones estimuladas es un ejemplo simple de cómo es posible una resolución más alta que supere el límite de difracción, pero tiene importantes limitaciones. STED es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza una combinación de pulsos de luz para inducir la fluorescencia en una pequeña subpoblación de moléculas fluorescentes en una muestra. Cada molécula produce un punto de luz limitado por difracción en la imagen, y el centro de cada uno de estos puntos corresponde a la ubicación de la molécula. Como el número de moléculas fluorescentes es bajo, es poco probable que los puntos de luz se superpongan y, por lo tanto, se pueden colocar con precisión. Este proceso luego se repite muchas veces para generar la imagen. Stefan Helldel Instituto Max Planck de Química Biofísica fue galardonado con el décimo Premio Alemán del Futuro en 2006 y el Premio Nobel de Química en 2014 por su desarrollo del microscopio STED y las metodologías asociadas. ^[50]

Alternativas

Para superar las limitaciones impuestas por el límite de difracción de la luz visible se han diseñado otros microscopios que utilizan otras ondas.

• Microscopio de fuerza atómica (AFM)
• Microscopio electrónico de barrido (SEM)
• Microscopía de barrido de conductancia de iones (SICM)
• Microscopio de barrido de efecto túnel (STM)
• Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
• Microscopio ultravioleta
• Microscopio de rayos x

Es importante tener en cuenta que las ondas de frecuencia más alta tienen una interacción limitada con la materia, por ejemplo, los tejidos blandos son relativamente transparentes a los rayos X, lo que da como resultado distintas fuentes de contraste y diferentes aplicaciones de destino.

El uso de electrones y rayos X en lugar de luz permite una resolución mucho más alta: la longitud de onda de la radiación es más corta, por lo que el límite de difracción es menor. Para hacer que la sonda de longitud de onda corta no sea destructiva, se ha propuesto y discutido ampliamente en la literatura el sistema de imágenes de haz atómico ( nanoscopio atómico ), pero aún no es competitivo con los sistemas de imágenes convencionales.

STM y AFM son técnicas de sonda de exploración que utilizan una pequeña sonda que se explora sobre la superficie de la muestra. La resolución en estos casos está limitada por el tamaño de la sonda; Las técnicas de micromaquinado pueden producir sondas con radios de punta de 5 a 10 nm.

Además, métodos como la microscopía electrónica o de rayos X utilizan vacío o vacío parcial, lo que limita su uso para muestras vivas y biológicas (con la excepción de un microscopio electrónico de barrido ambiental ). Las cámaras de muestras necesarias para todos estos instrumentos también limitan el tamaño de la muestra y la manipulación de la muestra es más difícil. El color no se puede ver en las imágenes creadas con estos métodos, por lo que se pierde parte de la información. Sin embargo, son esenciales cuando se investigan los efectos moleculares o atómicos, como el endurecimiento por envejecimiento en las aleaciones de aluminio o la microestructura de los polímeros .

Ver también

• Microscopio digital
• Iluminación Köhler
• Portaobjetos de microscopio

Referencias

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Fuentes citadas

• Van Helden, Albert; Dupre, Sven; Van Gent, Rob (2011). Los orígenes del telescopio . Prensa de la Universidad de Amsterdam. ISBN 978-9069846156.

Lectura adicional

• "Preparación de muestras metalográficas y materialográficas, microscopía óptica, análisis de imágenes y pruebas de dureza", Kay Geels en colaboración con Struers A / S, ASTM International 2006.
• "Microscopía de luz: una revolución contemporánea en curso" , Siegfried Weisenburger y Vahid Sandoghdar, arXiv: 1412.3255 2014.

Enlaces externos

• Antique Microscopes.com Una colección de microscopios antiguos
• Microscopios históricos , una colección ilustrada con más de 3000 fotos de microscopios científicos de fabricantes europeos (en alemán)
• La colección Golub , una colección de microscopios de los siglos XVII al XIX, que incluye descripciones detalladas
• Expresiones moleculares , conceptos en microscopía óptica
• Tutorial online de microscopía óptica práctica
• OpenWetWare
• Base de datos centrada en células
• Antonie van Leeuwenhoek: padre de microscopía y microbiología