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Una tira de ocho tubos de PCR, cada uno con una mezcla de reacción de 100 μL

La reacción en cadena de la polimerasa ( PCR ) es un método ampliamente utilizado para hacer rápidamente de millones a miles de millones de copias (copias completas o copias parciales) de una muestra de ADN específica , lo que permite a los científicos tomar una muestra muy pequeña de ADN y amplificarla (o una parte de it) en una cantidad lo suficientemente grande como para estudiarla en detalle. La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en Cetus Corporation . Es fundamental para muchos de los procedimientos utilizados en las pruebas e investigaciones genéticas, incluido el análisis de muestras antiguas de ADN y la identificación de agentes infecciosos. Mediante PCR, copias de cantidades muy pequeñas de secuencias de ADN.se amplifican exponencialmente en una serie de ciclos de cambios de temperatura. La PCR es ahora una técnica común y a menudo indispensable que se utiliza en la investigación de laboratorio médico para una amplia variedad de aplicaciones, incluida la investigación biomédica y la investigación forense criminal . [1] [2]

La mayoría de los métodos de PCR se basan en ciclos térmicos . Los ciclos térmicos exponen a los reactivos a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento para permitir diferentes reacciones dependientes de la temperatura, específicamente, la fusión del ADN y la replicación del ADN impulsada por enzimas . La PCR emplea dos reactivos principales: cebadores (que son fragmentos cortos de ADN de una sola hebra conocidos como oligonucleótidos que son una secuencia complementaria a la región del ADN diana) y una ADN polimerasa . En el primer paso de la PCR, las dos hebras de la doble hélice de ADN se separan físicamente a alta temperatura en un proceso llamado desnaturalización de ácidos nucleicos.. En el segundo paso, se baja la temperatura y los cebadores se unen a las secuencias complementarias de ADN. Las dos cadenas de ADN luego se convierten en plantillas para que la ADN polimerasa ensamble enzimáticamente una nueva cadena de ADN a partir de nucleótidos libres , los componentes básicos del ADN. A medida que avanza la PCR, el ADN generado se utiliza en sí mismo como plantilla para la replicación, lo que pone en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN original se amplifica exponencialmente .

Casi todas las aplicaciones de PCR emplean una ADN polimerasa termoestable, como la polimerasa Taq , una enzima aislada originalmente de la bacteria termófila Thermus aquaticus . Si la polimerasa utilizada fuera sensible al calor, se desnaturalizaría bajo las altas temperaturas de la etapa de desnaturalización. Antes del uso de la polimerasa Taq , la ADN polimerasa tenía que agregarse manualmente en cada ciclo, lo que era un proceso tedioso y costoso. [3]

Las aplicaciones de la técnica incluyen la clonación de ADN para secuenciación , clonación y manipulación de genes, mutagénesis de genes; construcción de filogenias basadas en ADN o análisis funcional de genes ; diagnóstico y seguimiento de enfermedades hereditarias ; amplificación de ADN antiguo; [4] análisis de huellas dactilares genéticas para la elaboración de perfiles de ADN (por ejemplo, en ciencia forense y pruebas de paternidad ); y detección de patógenos en pruebas de ácido nucleico para el diagnóstico de enfermedades infecciosas .

Colocación de una tira de ocho tubos de PCR en un termociclador

Principios [ editar ]

Un termociclador para PCR
Un termociclador de tres temperaturas más antiguo para PCR

La PCR amplifica una región específica de una hebra de ADN (el ADN diana). La mayoría de los métodos de PCR amplifican fragmentos de ADN de entre 0,1 y 10 kilopares de bases (kpb) de longitud, aunque algunas técnicas permiten la amplificación de fragmentos de hasta 40 kpb. [5] La cantidad de producto amplificado está determinada por los sustratos disponibles en la reacción, que se vuelve limitante a medida que avanza la reacción. [6]

Una configuración básica de PCR requiere varios componentes y reactivos, [7] que incluyen:

  • una plantilla de ADN que contiene la región diana de ADN para amplificar
  • una ADN polimerasa ; una enzima que polimeriza nuevas cadenas de ADN; La polimerasa Taq resistente al calor es especialmente común, [8] ya que es más probable que permanezca intacta durante el proceso de desnaturalización del ADN a alta temperatura.
  • dos cebadores de ADN que son complementarios a los extremos 3 '(tres primos) de cada una de las hebras sentido y antisentido del ADN objetivo (la ADN polimerasa solo puede unirse y alargarse a partir de una región de ADN de doble hebra; sin cebadores, no hay un sitio de iniciación de doble hebra en el que se pueda unir la polimerasa); [9] Los cebadores específicos que son complementarios a la región de ADN objetivo se seleccionan de antemano y, a menudo, se fabrican a medida en un laboratorio o se compran a proveedores bioquímicos comerciales.
  • Trifosfatos de desoxinucleósidos o dNTP (a veces llamados "trifosfatos de desoxinucleótidos"; nucleótidos que contienen grupos trifosfato), los componentes básicos a partir de los cuales la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN.
  • una solución tampón que proporciona un entorno químico adecuado para una actividad y estabilidad óptimas de la ADN polimerasa
  • cationes bivalentes , típicamenteiones magnesio (Mg) o manganeso (Mn); El Mg 2+ es el más común, pero el Mn 2+ puede usarse para mutagénesis de ADN mediada por PCR , ya que unaconcentraciónmás alta de Mn 2+ aumenta la tasa de error durante la síntesis de ADN; [10] y cationes monovalentes , típicamente iones de potasio (K) [se necesita una mejor fuente ]

La reacción se lleva a cabo habitualmente en un volumen de 10 a 200  μL en pequeños tubos de reacción (volúmenes de 0,2 a 0,5 ml) en un termociclador . El termociclador calienta y enfría los tubos de reacción para alcanzar las temperaturas requeridas en cada paso de la reacción (ver más abajo). Muchos termocicladores modernos utilizan el efecto Peltier , que permite calentar y enfriar el bloque que sostiene los tubos de PCR simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos de reacción de paredes delgadas permiten una conductividad térmica favorable para permitir un equilibrio térmico rápido. La mayoría de los termocicladores tienen tapas térmicas para evitar la condensación.en la parte superior del tubo de reacción. Los termocicladores más antiguos que carecen de una tapa caliente requieren una capa de aceite sobre la mezcla de reacción o una bola de cera dentro del tubo.

Procedimiento [ editar ]

Normalmente, la PCR consta de una serie de 20 a 40 cambios de temperatura repetidos, denominados ciclos térmicos, y cada ciclo suele constar de dos o tres pasos de temperatura discretos (consulte la figura siguiente). El ciclo suele estar precedido por un solo paso de temperatura a una temperatura muy alta (> 90 ° C (194 ° F)), y seguido de una retención al final para la extensión del producto final o un breve almacenamiento. Las temperaturas utilizadas y el tiempo que se aplican en cada ciclo dependen de una variedad de parámetros, incluida la enzima utilizada para la síntesis de ADN, la concentración de iones bivalentes y dNTP en la reacción y la temperatura de fusión ( T m ) del imprimaciones. [11] Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes:

  • Inicialización : este paso solo es necesario para las ADN polimerasas que requieren activación por calor mediante PCR de inicio en caliente . [12] Consiste en calentar la cámara de reacción a una temperatura de 94–96 ° C (201–205 ° F), o 98 ° C (208 ° F) si se utilizan polimerasas extremadamente termoestables, que luego se mantiene durante 1– 10 minutos.
  • Desnaturalización : este paso es el primer evento cíclico regular y consiste en calentar la cámara de reacción a 94–98 ° C (201–208 ° F) durante 20–30 segundos. Esto provoca la fusión o desnaturalización del ADN de la plantilla de ADN de doble hebra al romper los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias, dando lugar a dos moléculas de ADN de hebra sencilla.
  • Recocido : en el siguiente paso, la temperatura de reacción se reduce a 50-65 ° C (122-149 ° F) durante 20-40 segundos, lo que permite el apareamiento de los cebadores a cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región diana. Los cebadores son secuencias de una sola hebra, pero son mucho más cortos que la longitud de la región diana, y complementan sólo secuencias muy cortas en el extremo 3 'de cada hebra.
Es fundamental determinar una temperatura adecuada para el paso de recocido porque la eficiencia y la especificidad se ven fuertemente afectadas por la temperatura de recocido. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja para permitir la hibridación del cebador con la hebra, pero lo suficientemente alta para que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse sólo a una parte perfectamente complementaria de la hebra y en ningún otro lugar. Si la temperatura es demasiado baja, la imprimación puede adherirse imperfectamente. Si es demasiado alto, es posible que la imprimación no se adhiera en absoluto. Una temperatura de recocido típica es de aproximadamente 3-5 ° C por debajo de la T mde los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre bases complementarias se forman solo cuando la secuencia del cebador coincide muy de cerca con la secuencia de la plantilla. Durante este paso, la polimerasa se une al híbrido cebador-molde y comienza la formación de ADN.
  • Extensión / elongación : la temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; la temperatura de actividad óptima para la ADN polimerasa termoestable de la polimerasa Taq es aproximadamente 75-80 ° C (167-176 ° F), [13] [14] aunque una temperatura de 72 ° C (162 ° F) se usa comúnmente con este enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena de la plantilla de ADN añadiendo dNTP libres de la mezcla de reacción que es complementaria a la plantilla en la dirección 5'-a-3 ' , condensando el grupo 5'- fosfato de los dNTP con el grupo 3′- hidroxial final de la cadena de ADN naciente (alargada). El tiempo preciso requerido para el alargamiento depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región diana del ADN para amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debido a sustratos o reactivos limitantes), en cada etapa de extensión / alargamiento, el número de secuencias diana de ADN se duplica. Con cada ciclo sucesivo, las hebras de plantilla originales más todas las hebras recién generadas se convierten en hebras de plantilla para la siguiente ronda de elongación, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región diana de ADN específica.
Los procesos de desnaturalización, recocido y alargamiento constituyen un solo ciclo. Se requieren múltiples ciclos para amplificar el ADN objetivo a millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas después de un número determinado de ciclos es 2 n , donde n es el número de ciclos. Por lo tanto, una reacción establecida para 30 ciclos da como resultado 2 30 , o 1.073.741.824, copias de la región diana de ADN de doble hebra original.
  • Alargamiento final : este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70 a 74 ° C (158 a 165 ° F) (el rango de temperatura requerido para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en la PCR) durante 5 a 15 minutos después de la último ciclo de PCR para asegurar que cualquier ADN monocatenario restante esté completamente alargado.
  • Retención final : el paso final enfría la cámara de reacción a 4–15 ° C (39–59 ° F) durante un tiempo indefinido, y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de PCR.
Productos de PCR teñidos con bromuro de etidio después de electroforesis en gel . Se utilizaron dos conjuntos de cebadores para amplificar una secuencia diana de tres muestras de tejido diferentes. No hay amplificación presente en la muestra # 1; Las bandas de ADN en las muestras n. ° 2 y n. ° 3 indican una amplificación exitosa de la secuencia diana. El gel también muestra un control positivo y una escalera de ADN que contiene fragmentos de ADN de longitud definida para dimensionar las bandas en las PCR experimentales.

Para comprobar si la PCR generó con éxito la región diana de ADN anticipada (también denominada a veces amplímero o amplicón ), se puede emplear electroforesis en gel de agarosa para la separación por tamaños de los productos de PCR. El tamaño de los productos de la PCR se determina comparándolo con una escalera de ADN , un marcador de peso molecular que contiene fragmentos de ADN de tamaños conocidos, que corre en el gel junto con los productos de la PCR.

Etapas [ editar ]

Al igual que con otras reacciones químicas, la velocidad de reacción y la eficiencia de la PCR se ven afectadas por factores limitantes. Por lo tanto, todo el proceso de PCR se puede dividir en tres etapas según el progreso de la reacción:

  • Amplificación exponencial : en cada ciclo, la cantidad de producto se duplica (asumiendo una eficiencia de reacción del 100%). Después de 30 ciclos, una sola copia de ADN se puede incrementar hasta 1,000,000,000 (mil millones) de copias. Entonces, en cierto sentido, la replicación de una hebra discreta de ADN se está manipulando en un tubo en condiciones controladas. [15] La reacción es muy sensible: solo deben estar presentes cantidades diminutas de ADN.
  • Etapa de nivelación : la reacción se ralentiza a medida que la ADN polimerasa pierde actividad y el consumo de reactivos, como dNTP y cebadores, hace que se vuelvan más limitados.
  • Meseta : No se acumula más producto debido al agotamiento de los reactivos y la enzima.

Optimización [ editar ]

Artículo principal: optimización de PCR

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, en parte debido a su sensibilidad a la contaminación que causa la amplificación de productos de ADN falsos. Debido a esto, se han desarrollado varias técnicas y procedimientos para optimizar las condiciones de la PCR. [16] [17] La contaminación con ADN extraño se aborda con protocolos y procedimientos de laboratorio que separan las mezclas previas a la PCR de los posibles contaminantes del ADN. [7]Esto generalmente implica la separación espacial de las áreas de preparación de PCR de las áreas para el análisis o purificación de productos de PCR, el uso de recipientes de plástico desechables y la limpieza a fondo de la superficie de trabajo entre las configuraciones de reacción. Las técnicas de diseño de cebadores son importantes para mejorar el rendimiento del producto de PCR y para evitar la formación de productos falsos, y el uso de componentes tampón alternativos o enzimas polimerasas puede ayudar con la amplificación de regiones de ADN largas o problemáticas de otro modo. La adición de reactivos, como formamida , en sistemas tampón puede aumentar la especificidad y el rendimiento de la PCR. [18] Se pueden realizar simulaciones por computadora de los resultados teóricos de la PCR ( PCR electrónica ) para ayudar en el diseño del cebador. [19]

Aplicaciones [ editar ]

Aislamiento selectivo de ADN [ editar ]

La PCR permite el aislamiento de fragmentos de ADN a partir de ADN genómico mediante la amplificación selectiva de una región específica de ADN. Este uso de la PCR aumenta de muchas formas, como la generación de sondas de hibridación para la hibridación Southern o Northern y la clonación de ADN , que requieren mayores cantidades de ADN, que representan una región de ADN específica. La PCR proporciona a estas técnicas grandes cantidades de ADN puro, lo que permite el análisis de muestras de ADN incluso a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida.

Otras aplicaciones de la PCR incluyen la secuenciación de ADN para determinar secuencias desconocidas amplificadas por PCR en las que uno de los cebadores de amplificación puede usarse en la secuenciación de Sanger , el aislamiento de una secuencia de ADN para acelerar las tecnologías de ADN recombinante que implican la inserción de una secuencia de ADN en un plásmido , fago , o cósmido (dependiendo del tamaño) o el material genético de otro organismo. Las colonias bacterianas (como E. coli ) se pueden rastrear rápidamente mediante PCR en busca de construcciones de vector de ADN correctas . [20] La PCR también puede usarse para la toma de huellas genéticas; una técnica forense utilizada para identificar a una persona u organismo mediante la comparación de ADN experimentales a través de diferentes métodos basados ​​en PCR.

Electroforesis de fragmentos de ADN amplificados por PCR:
  1. Padre
  2. Niño
  3. Mamá

El niño ha heredado algunas, pero no todas, las huellas dactilares de cada uno de sus padres, lo que le da una huella dactilar nueva y única.

Algunos métodos de huellas dactilares de PCR tienen un alto poder discriminativo y pueden usarse para identificar relaciones genéticas entre individuos, como padres e hijos o entre hermanos, y se usan en pruebas de paternidad (Fig. 4). Esta técnica también se puede utilizar para determinar las relaciones evolutivas entre organismos cuando se utilizan ciertos relojes moleculares (es decir, los genes de ARNr 16S y recA de microorganismos). [21]

Amplificación y cuantificación de ADN [ editar ]

Ver también: Uso de ADN en entomología forense

Debido a que la PCR amplifica las regiones de ADN a las que se dirige, la PCR se puede utilizar para analizar cantidades extremadamente pequeñas de muestra. Esto suele ser fundamental para el análisis forense , cuando solo se dispone de una pequeña cantidad de ADN como prueba. La PCR también se puede utilizar en el análisis de ADN antiguo que tiene decenas de miles de años. Estas técnicas basadas en PCR se han utilizado con éxito en animales, como un mamut de cuarenta mil años , y también en ADN humano, en aplicaciones que van desde el análisis de momias egipcias hasta la identificación de un zar ruso y el cuerpo de El rey inglés Ricardo III . [22]

Los métodos de PCR cuantitativa o PCR en tiempo real (qPCR, [23] que no debe confundirse con RT-PCR ) permiten estimar la cantidad de una secuencia dada presente en una muestra, una técnica que a menudo se aplica para determinar cuantitativamente los niveles de expresión génica . La PCR cuantitativa es una herramienta establecida para la cuantificación de ADN que mide la acumulación de producto de ADN después de cada ronda de amplificación por PCR.

qPCR permite la cuantificación y detección de una secuencia de ADN específica en tiempo real ya que mide la concentración mientras se lleva a cabo el proceso de síntesis. Hay dos métodos para la detección y cuantificación simultáneas. El primer método consiste en utilizar fluorescentestintes que se retienen de forma inespecífica entre las hebras dobles. El segundo método implica sondas que codifican secuencias específicas y están marcadas con fluorescencia. La detección de ADN utilizando estos métodos solo se puede ver después de que tenga lugar la hibridación de las sondas con su ADN complementario. Una combinación de técnicas interesante es la PCR en tiempo real y la transcripción inversa. Esta sofisticada técnica, denominada RT-qPCR, permite la cuantificación de una pequeña cantidad de ARN. A través de esta técnica combinada, el ARNm se convierte en ADNc, que se cuantifica adicionalmente usando qPCR. Esta técnica reduce la posibilidad de error en el punto final de la PCR, [24] aumentando las posibilidades de detección de genes asociados con enfermedades genéticas como el cáncer. [4]Los laboratorios utilizan RT-qPCR con el fin de medir con sensibilidad la regulación génica. Los fundamentos matemáticos para la cuantificación confiable de la PCR [25] y RT-qPCR [26] facilitan la implementación de procedimientos de ajuste precisos de datos experimentales en aplicaciones de investigación, médicas, de diagnóstico y de enfermedades infecciosas. [27] [28] [29] [30]

Aplicaciones médicas y de diagnóstico [ editar ]

Los futuros padres pueden someterse a pruebas para determinar si son portadores genéticos , o sus hijos pueden someterse a pruebas para ver si están realmente afectados por una enfermedad . [1] Se pueden obtener muestras de ADN para pruebas prenatales mediante amniocentesis , muestreo de vellosidades coriónicas o incluso mediante el análisis de células fetales raras que circulan en el torrente sanguíneo de la madre. El análisis de PCR también es esencial para el diagnóstico genético previo a la implantación , en el que las células individuales de un embrión en desarrollo se analizan para detectar mutaciones.

  • La PCR también se puede utilizar como parte de una prueba sensible para la tipificación de tejidos , vital para el trasplante de órganos . A partir de 2008, existe incluso una propuesta para reemplazar las pruebas tradicionales basadas en anticuerpos para el tipo de sangre por pruebas basadas en PCR. [31]
  • Muchas formas de cáncer implican alteraciones de los oncogenes . Al utilizar pruebas basadas en PCR para estudiar estas mutaciones, los regímenes de terapia a veces se pueden personalizar individualmente para un paciente. La PCR permite el diagnóstico precoz de enfermedades malignas como la leucemia y los linfomas , que actualmente es el más desarrollado en la investigación del cáncer y ya se utiliza de forma rutinaria. Los ensayos de PCR se pueden realizar directamente en muestras de ADN genómico para detectar células malignas específicas de translocación a una sensibilidad que sea al menos 10.000 veces mayor que la de otros métodos. [32]La PCR es muy útil en el campo médico ya que permite el aislamiento y amplificación de supresores de tumores. La PCR cuantitativa, por ejemplo, se puede utilizar para cuantificar y analizar células individuales, así como para reconocer confirmaciones y combinaciones de ADN, ARNm y proteínas. [24]

Aplicaciones para enfermedades infecciosas [ editar ]

La PCR permite un diagnóstico rápido y altamente específico de enfermedades infecciosas, incluidas las causadas por bacterias o virus. [33] La PCR también permite la identificación de microorganismos no cultivables o de crecimiento lento, como micobacterias , bacterias anaerobias o virus a partir de ensayos de cultivo de tejidos y modelos animales . La base de las aplicaciones de diagnóstico de la PCR en microbiología es la detección de agentes infecciosos y la discriminación de cepas no patógenas de las patógenas en virtud de genes específicos. [33] [34]

La PCR ha revolucionado la caracterización y detección de organismos de enfermedades infecciosas de las siguientes formas:

  • El virus de la inmunodeficiencia humana (o VIH ) es un objetivo difícil de encontrar y erradicar. Las primeras pruebas de infección se basaron en la presencia de anticuerpos contra el virus que circulaban en el torrente sanguíneo. Sin embargo, los anticuerpos no aparecen hasta muchas semanas después de la infección, los anticuerpos maternos enmascaran la infección de un recién nacido y los agentes terapéuticos para combatir la infección no afectan a los anticuerpos. Se han desarrollado pruebas de PCR que pueden detectar tan solo un genoma viral entre el ADN de más de 50.000 células huésped. [35] Las infecciones se pueden detectar antes, la sangre donada se puede analizar directamente para detectar el virus, los recién nacidos pueden someterse a pruebas de infección de inmediato y los efectos de los tratamientos antivirales se pueden cuantificar.
  • Algunos organismos patógenos, como el de la tuberculosis , son difíciles de extraer de los pacientes y su cultivo en el laboratorio es lento . Las pruebas basadas en PCR han permitido la detección de pequeñas cantidades de organismos patógenos (vivos o muertos), en muestras convenientes . También se puede utilizar un análisis genético detallado para detectar la resistencia a los antibióticos, lo que permite una terapia inmediata y eficaz. Los efectos de la terapia también se pueden evaluar de inmediato.
  • La propagación de un organismo patógeno a través de poblaciones de animales domésticos o salvajes se puede controlar mediante pruebas de PCR. En muchos casos, se puede detectar y controlar la aparición de nuevos subtipos virulentos . Los subtipos de un organismo que fueron responsables de epidemias anteriores también se pueden determinar mediante análisis de PCR.
  • El ADN viral puede detectarse mediante PCR. Los cebadores utilizados deben ser específicos de las secuencias diana en el ADN de un virus, y la PCR puede usarse para análisis de diagnóstico o secuenciación de ADN del genoma viral. La alta sensibilidad de la PCR permite la detección del virus poco después de la infección e incluso antes del inicio de la enfermedad. [33] Esta detección temprana puede dar a los médicos un tiempo de espera significativo en el tratamiento. La cantidad de virus (" carga viral ") en un paciente también se puede cuantificar mediante técnicas de cuantificación de ADN basadas en PCR (ver más abajo). Una variante de PCR ( RT-PCR) is used for detecting viral RNA rather than DNA: in this test the enzyme reverse transcriptase is used to generate a DNA sequence which matches the viral RNA; this DNA is then amplified as per the usual PCR method. RT-PCR is widely used to detect the SARS-CoV-2 viral genome.[36]
  • Diseases such as pertussis (or whooping cough) are caused by the bacteria Bordetella pertussis. This bacteria is marked by a serious acute respiratory infection that affects various animals and humans and has led to the deaths of many young children. The pertussis toxin is a protein exotoxin that binds to cell receptors by two dimers and reacts with different cell types such as T lymphocytes which play a role in cell immunity.[37] PCR is an important testing tool that can detect sequences within the gene for the pertussis toxin. Because PCR has a high sensitivity for the toxin and a rapid turnaround time, it is very efficient for diagnosing pertussis when compared to culture.[38]

Forensic applications[edit]

The development of PCR-based genetic (or DNA) fingerprinting protocols has seen widespread application in forensics:

  • In its most discriminating form, genetic fingerprinting can uniquely discriminate any one person from the entire population of the world. Minute samples of DNA can be isolated from a crime scene, and compared to that from suspects, or from a DNA database of earlier evidence or convicts. Simpler versions of these tests are often used to rapidly rule out suspects during a criminal investigation. Evidence from decades-old crimes can be tested, confirming or exonerating the people originally convicted.
  • Forensic DNA typing has been an effective way of identifying or exonerating criminal suspects due to analysis of evidence discovered at a crime scene. The human genome has many repetitive regions that can be found within gene sequences or in non-coding regions of the genome. Specifically, up to 40% of human DNA is repetitive.[4] There are two distinct categories for these repetitive, non-coding regions in the genome. The first category is called variable number tandem repeats (VNTR), which are 10–100 base pairs long and the second category is called short tandem repeats (STR) and these consist of repeated 2–10 base pair sections. PCR is used to amplify several well-known VNTRs and STRs using primers that flank each of the repetitive regions. The sizes of the fragments obtained from any individual for each of the STRs will indicate which alleles are present. By analyzing several STRs for an individual, a set of alleles for each person will be found that statistically is likely to be unique.[4] Researchers have identified the complete sequence of the human genome. This sequence can be easily accessed through the NCBI website and is used in many real-life applications. For example, the FBI has compiled a set of DNA marker sites used for identification, and these are called the Combined DNA Index System (CODIS) DNA database.[4] Using this database enables statistical analysis to be used to determine the probability that a DNA sample will match. PCR is a very powerful and significant analytical tool to use for forensic DNA typing because researchers only need a very small amount of the target DNA to be used for analysis. For example, a single human hair with attached hair follicle has enough DNA to conduct the analysis. Similarly, a few sperm, skin samples from under the fingernails, or a small amount of blood can provide enough DNA for conclusive analysis.[4]
  • Less discriminating forms of DNA fingerprinting can help in DNA paternity testing, where an individual is matched with their close relatives. DNA from unidentified human remains can be tested, and compared with that from possible parents, siblings, or children. Similar testing can be used to confirm the biological parents of an adopted (or kidnapped) child. The actual biological father of a newborn can also be confirmed (or ruled out).
  • The PCR AMGX/AMGY design has been shown to not only[clarification needed] facilitate in amplifying DNA sequences from a very minuscule amount of genome. However it can also be used for real-time sex determination from forensic bone samples. This provides a powerful and effective way to determine gender in forensic cases and ancient specimens.[39]

Research applications[edit]

PCR has been applied to many areas of research in molecular genetics:

  • PCR allows rapid production of short pieces of DNA, even when not more than the sequence of the two primers is known. This ability of PCR augments many methods, such as generating hybridization probes for Southern or northern blot hybridization. PCR supplies these techniques with large amounts of pure DNA, sometimes as a single strand, enabling analysis even from very small amounts of starting material.
  • The task of DNA sequencing can also be assisted by PCR. Known segments of DNA can easily be produced from a patient with a genetic disease mutation. Modifications to the amplification technique can extract segments from a completely unknown genome, or can generate just a single strand of an area of interest.
  • PCR has numerous applications to the more traditional process of DNA cloning. It can extract segments for insertion into a vector from a larger genome, which may be only available in small quantities. Using a single set of 'vector primers', it can also analyze or extract fragments that have already been inserted into vectors. Some alterations to the PCR protocol can generate mutations (general or site-directed) of an inserted fragment.
  • Sequence-tagged sites is a process where PCR is used as an indicator that a particular segment of a genome is present in a particular clone. The Human Genome Project found this application vital to mapping the cosmid clones they were sequencing, and to coordinating the results from different laboratories.
  • An application of PCR is the phylogenic analysis of DNA from ancient sources, such as that found in the recovered bones of Neanderthals, from frozen tissues of mammoths, or from the brain of Egyptian mummies.[15] In some cases the highly degraded DNA from these sources might be reassembled during the early stages of amplification.
  • A common application of PCR is the study of patterns of gene expression. Tissues (or even individual cells) can be analyzed at different stages to see which genes have become active, or which have been switched off. This application can also use quantitative PCR to quantitate the actual levels of expression
  • The ability of PCR to simultaneously amplify several loci from individual sperm[40] has greatly enhanced the more traditional task of genetic mapping by studying chromosomal crossovers after meiosis. Rare crossover events between very close loci have been directly observed by analyzing thousands of individual sperms. Similarly, unusual deletions, insertions, translocations, or inversions can be analyzed, all without having to wait (or pay) for the long and laborious processes of fertilization, embryogenesis, etc.
  • Site-directed mutagenesis: PCR can be used to create mutant genes with mutations chosen by scientists at will. These mutations can be chosen in order to understand how proteins accomplish their functions, and to change or improve protein function.

Advantages[edit]

PCR has a number of advantages. It is fairly simple to understand and to use, and produces results rapidly. The technique is highly sensitive with the potential to produce millions to billions of copies of a specific product for sequencing, cloning, and analysis. qRT-PCR shares the same advantages as the PCR, with an added advantage of quantification of the synthesized product. Therefore, it has its uses to analyze alterations of gene expression levels in tumors, microbes, or other disease states.[24]

PCR is a very powerful and practical research tool. The sequencing of unknown etiologies of many diseases are being figured out by the PCR. The technique can help identify the sequence of previously unknown viruses related to those already known and thus give us a better understanding of the disease itself. If the procedure can be further simplified and sensitive non radiometric detection systems can be developed, the PCR will assume a prominent place in the clinical laboratory for years to come.[15]

Limitations[edit]

One major limitation of PCR is that prior information about the target sequence is necessary in order to generate the primers that will allow its selective amplification.[24] This means that, typically, PCR users must know the precise sequence(s) upstream of the target region on each of the two single-stranded templates in order to ensure that the DNA polymerase properly binds to the primer-template hybrids and subsequently generates the entire target region during DNA synthesis.

Like all enzymes, DNA polymerases are also prone to error, which in turn causes mutations in the PCR fragments that are generated.[41]

Another limitation of PCR is that even the smallest amount of contaminating DNA can be amplified, resulting in misleading or ambiguous results. To minimize the chance of contamination, investigators should reserve separate rooms for reagent preparation, the PCR, and analysis of product. Reagents should be dispensed into single-use aliquots. Pipettors with disposable plungers and extra-long pipette tips should be routinely used.[15]

Environmental samples that contain humic acids may inhibit PCR amplification and lead to inaccurate results.

Variations[edit]

Main article: Variants of PCR
  • Allele-specific PCR: a diagnostic or cloning technique based on single-nucleotide variations (SNVs not to be confused with SNPs) (single-base differences in a patient). It requires prior knowledge of a DNA sequence, including differences between alleles, and uses primers whose 3' ends encompass the SNV (base pair buffer around SNV usually incorporated). PCR amplification under stringent conditions is much less efficient in the presence of a mismatch between template and primer, so successful amplification with an SNP-specific primer signals presence of the specific SNP in a sequence.[42] See SNP genotyping for more information.
  • Assembly PCR or Polymerase Cycling Assembly (PCA): artificial synthesis of long DNA sequences by performing PCR on a pool of long oligonucleotides with short overlapping segments. The oligonucleotides alternate between sense and antisense directions, and the overlapping segments determine the order of the PCR fragments, thereby selectively producing the final long DNA product.[43]
  • Asymmetric PCR: preferentially amplifies one DNA strand in a double-stranded DNA template. It is used in sequencing and hybridization probing where amplification of only one of the two complementary strands is required. PCR is carried out as usual, but with a great excess of the primer for the strand targeted for amplification. Because of the slow (arithmetic) amplification later in the reaction after the limiting primer has been used up, extra cycles of PCR are required.[44] A recent modification on this process, known as Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), uses a limiting primer with a higher melting temperature (Tm) than the excess primer to maintain reaction efficiency as the limiting primer concentration decreases mid-reaction.[45]
  • Convective PCR: a pseudo-isothermal way of performing PCR. Instead of repeatedly heating and cooling the PCR mixture, the solution is subjected to a thermal gradient. The resulting thermal instability driven convective flow automatically shuffles the PCR reagents from the hot and cold regions repeatedly enabling PCR.[46] Parameters such as thermal boundary conditions and geometry of the PCR enclosure can be optimized to yield robust and rapid PCR by harnessing the emergence of chaotic flow fields.[47] Such convective flow PCR setup significantly reduces device power requirement and operation time.
  • Dial-out PCR: a highly parallel method for retrieving accurate DNA molecules for gene synthesis. A complex library of DNA molecules is modified with unique flanking tags before massively parallel sequencing. Tag-directed primers then enable the retrieval of molecules with desired sequences by PCR.[48]
  • Digital PCR (dPCR): used to measure the quantity of a target DNA sequence in a DNA sample. The DNA sample is highly diluted so that after running many PCRs in parallel, some of them do not receive a single molecule of the target DNA. The target DNA concentration is calculated using the proportion of negative outcomes. Hence the name 'digital PCR'.
  • Helicase-dependent amplification: similar to traditional PCR, but uses a constant temperature rather than cycling through denaturation and annealing/extension cycles. DNA helicase, an enzyme that unwinds DNA, is used in place of thermal denaturation.[49]
  • Hot start PCR: a technique that reduces non-specific amplification during the initial set up stages of the PCR. It may be performed manually by heating the reaction components to the denaturation temperature (e.g., 95 °C) before adding the polymerase.[50] Specialized enzyme systems have been developed that inhibit the polymerase's activity at ambient temperature, either by the binding of an antibody[12][51] or by the presence of covalently bound inhibitors that dissociate only after a high-temperature activation step. Hot-start/cold-finish PCR is achieved with new hybrid polymerases that are inactive at ambient temperature and are instantly activated at elongation temperature.
  • In silico PCR (digital PCR, virtual PCR, electronic PCR, e-PCR) refers to computational tools used to calculate theoretical polymerase chain reaction results using a given set of primers (probes) to amplify DNA sequences from a sequenced genome or transcriptome. In silico PCR was proposed as an educational tool for molecular biology.[52]
  • Intersequence-specific PCR (ISSR): a PCR method for DNA fingerprinting that amplifies regions between simple sequence repeats to produce a unique fingerprint of amplified fragment lengths.[53]
  • Inverse PCR: is commonly used to identify the flanking sequences around genomic inserts. It involves a series of DNA digestions and self ligation, resulting in known sequences at either end of the unknown sequence.[54]
  • Ligation-mediated PCR: uses small DNA linkers ligated to the DNA of interest and multiple primers annealing to the DNA linkers; it has been used for DNA sequencing, genome walking, and DNA footprinting.[55]
  • Methylation-specific PCR (MSP): developed by Stephen Baylin and James G. Herman at the Johns Hopkins School of Medicine,[56] and is used to detect methylation of CpG islands in genomic DNA. DNA is first treated with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosine bases to uracil, which is recognized by PCR primers as thymine. Two PCRs are then carried out on the modified DNA, using primer sets identical except at any CpG islands within the primer sequences. At these points, one primer set recognizes DNA with cytosines to amplify methylated DNA, and one set recognizes DNA with uracil or thymine to amplify unmethylated DNA. MSP using qPCR can also be performed to obtain quantitative rather than qualitative information about methylation.
  • Miniprimer PCR: uses a thermostable polymerase (S-Tbr) that can extend from short primers ("smalligos") as short as 9 or 10 nucleotides. This method permits PCR targeting to smaller primer binding regions, and is used to amplify conserved DNA sequences, such as the 16S (or eukaryotic 18S) rRNA gene.[57]
  • Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA): permits amplifying multiple targets with a single primer pair, thus avoiding the resolution limitations of multiplex PCR (see below).
  • Multiplex-PCR: consists of multiple primer sets within a single PCR mixture to produce amplicons of varying sizes that are specific to different DNA sequences. By targeting multiple genes at once, additional information may be gained from a single test-run that otherwise would require several times the reagents and more time to perform. Annealing temperatures for each of the primer sets must be optimized to work correctly within a single reaction, and amplicon sizes. That is, their base pair length should be different enough to form distinct bands when visualized by gel electrophoresis.
  • Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR): some nanoparticles (NPs) can enhance the efficiency of PCR (thus being called nanoPCR), and some can even outperform the original PCR enhancers. It was reported that quantum dots (QDs) can improve PCR specificity and efficiency. Single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) and multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) are efficient in enhancing the amplification of long PCR. Carbon nanopowder (CNP) can improve the efficiency of repeated PCR and long PCR, while zinc oxide, titanium dioxide and Ag NPs were found to increase the PCR yield. Previous data indicated that non-metallic NPs retained acceptable amplification fidelity. Given that many NPs are capable of enhancing PCR efficiency, it is clear that there is likely to be great potential for nanoPCR technology improvements and product development.[58][59]
  • Nested PCR: increases the specificity of DNA amplification, by reducing background due to non-specific amplification of DNA. Two sets of primers are used in two successive PCRs. In the first reaction, one pair of primers is used to generate DNA products, which besides the intended target, may still consist of non-specifically amplified DNA fragments. The product(s) are then used in a second PCR with a set of primers whose binding sites are completely or partially different from and located 3' of each of the primers used in the first reaction. Nested PCR is often more successful in specifically amplifying long DNA fragments than conventional PCR, but it requires more detailed knowledge of the target sequences.
  • Overlap-extension PCR or Splicing by overlap extension (SOEing) : a genetic engineering technique that is used to splice together two or more DNA fragments that contain complementary sequences. It is used to join DNA pieces containing genes, regulatory sequences, or mutations; the technique enables creation of specific and long DNA constructs. It can also introduce deletions, insertions or point mutations into a DNA sequence.[60][61]
  • PAN-AC: uses isothermal conditions for amplification, and may be used in living cells.[62][63]
  • quantitative PCR (qPCR): used to measure the quantity of a target sequence (commonly in real-time). It quantitatively measures starting amounts of DNA, cDNA, or RNA. quantitative PCR is commonly used to determine whether a DNA sequence is present in a sample and the number of its copies in the sample. Quantitative PCR has a very high degree of precision. Quantitative PCR methods use fluorescent dyes, such as Sybr Green, EvaGreen or fluorophore-containing DNA probes, such as TaqMan, to measure the amount of amplified product in real time. It is also sometimes abbreviated to RT-PCR (real-time PCR) but this abbreviation should be used only for reverse transcription PCR. qPCR is the appropriate contractions for quantitative PCR (real-time PCR).
  • Reverse Complement PCR (RC-PCR): Allows the addition of functional domains or sequences of choice to be appended independently to either end of the generated amplicon in a single closed tube reaction. This method generates target specific primers within the reaction by the interaction of universal primers (which contain the desired sequences or domains to be appended) and RC probes.
  • Reverse Transcription PCR (RT-PCR): for amplifying DNA from RNA. Reverse transcriptase reverse transcribes RNA into cDNA, which is then amplified by PCR. RT-PCR is widely used in expression profiling, to determine the expression of a gene or to identify the sequence of an RNA transcript, including transcription start and termination sites. If the genomic DNA sequence of a gene is known, RT-PCR can be used to map the location of exons and introns in the gene. The 5' end of a gene (corresponding to the transcription start site) is typically identified by RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends).
  • RNase H-dependent PCR (rhPCR): a modification of PCR that utilizes primers with a 3’ extension block that can be removed by a thermostable RNase HII enzyme. This system reduces primer-dimers and allows for multiplexed reactions to be performed with higher numbers of primers.[64]
  • Single Specific Primer-PCR (SSP-PCR): allows the amplification of double-stranded DNA even when the sequence information is available at one end only. This method permits amplification of genes for which only a partial sequence information is available, and allows unidirectional genome walking from known into unknown regions of the chromosome.[65]
  • Solid Phase PCR: encompasses multiple meanings, including Polony Amplification (where PCR colonies are derived in a gel matrix, for example), Bridge PCR[66] (primers are covalently linked to a solid-support surface), conventional Solid Phase PCR (where Asymmetric PCR is applied in the presence of solid support bearing primer with sequence matching one of the aqueous primers) and Enhanced Solid Phase PCR[67] (where conventional Solid Phase PCR can be improved by employing high Tm and nested solid support primer with optional application of a thermal 'step' to favour solid support priming).
  • Suicide PCR: typically used in paleogenetics or other studies where avoiding false positives and ensuring the specificity of the amplified fragment is the highest priority. It was originally described in a study to verify the presence of the microbe Yersinia pestis in dental samples obtained from 14th Century graves of people supposedly killed by the plague during the medieval Black Death epidemic.[68] The method prescribes the use of any primer combination only once in a PCR (hence the term "suicide"), which should never have been used in any positive control PCR reaction, and the primers should always target a genomic region never amplified before in the lab using this or any other set of primers. This ensures that no contaminating DNA from previous PCR reactions is present in the lab, which could otherwise generate false positives.
  • Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR): for isolation of an unknown sequence flanking a known sequence. Within the known sequence, TAIL-PCR uses a nested pair of primers with differing annealing temperatures; a degenerate primer is used to amplify in the other direction from the unknown sequence.[69]
  • Touchdown PCR (Step-down PCR): a variant of PCR that aims to reduce nonspecific background by gradually lowering the annealing temperature as PCR cycling progresses. The annealing temperature at the initial cycles is usually a few degrees (3–5 °C) above the Tm of the primers used, while at the later cycles, it is a few degrees (3–5 °C) below the primer Tm. The higher temperatures give greater specificity for primer binding, and the lower temperatures permit more efficient amplification from the specific products formed during the initial cycles.[70]
  • Universal Fast Walking: for genome walking and genetic fingerprinting using a more specific 'two-sided' PCR than conventional 'one-sided' approaches (using only one gene-specific primer and one general primer—which can lead to artefactual 'noise')[71] by virtue of a mechanism involving lariat structure formation. Streamlined derivatives of UFW are LaNe RAGE (lariat-dependent nested PCR for rapid amplification of genomic DNA ends),[72] 5'RACE LaNe[73] and 3'RACE LaNe.[74]

History[edit]

Diagrammatic representation of an example primer pair. The use of primers in an in vitro assay to allow DNA synthesis was a major innovation that allowed the development of PCR.
Main article: History of polymerase chain reaction

The heat-resistant enzymes that are a key component in polymerase chain reaction were discovered in the 1960s as a product of a microbial life form that lived in the superheated waters of Yellowstone’s Mushroom Spring.[75]

A 1971 paper in the Journal of Molecular Biology by Kjell Kleppe and co-workers in the laboratory of H. Gobind Khorana first described a method of using an enzymatic assay to replicate a short DNA template with primers in vitro.[76] However, this early manifestation of the basic PCR principle did not receive much attention at the time and the invention of the polymerase chain reaction in 1983 is generally credited to Kary Mullis.[77]

"Baby Blue", a 1986 prototype machine for doing PCR

When Mullis developed the PCR in 1983, he was working in Emeryville, California for Cetus Corporation, one of the first biotechnology companies, where he was responsible for synthesizing short chains of DNA. Mullis has written that he conceived the idea for PCR while cruising along the Pacific Coast Highway one night in his car.[78] He was playing in his mind with a new way of analyzing changes (mutations) in DNA when he realized that he had instead invented a method of amplifying any DNA region through repeated cycles of duplication driven by DNA polymerase. In Scientific American, Mullis summarized the procedure: "Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon. The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube, a few simple reagents, and a source of heat."[79] DNA fingerprinting was first used for paternity testing in 1988.[80]

Mullis and Professor Michael Smith, who had developed other essential ways of manipulating DNA,[81] were jointly awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993, seven years after Mullis and his colleagues at Cetus first put his proposal to practice.[82] Mullis's 1985 paper with R. K. Saiki and H. A. Erlich, "Enzymatic Amplification of β-globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia"—the polymerase chain reaction invention (PCR) – was honored by a Citation for Chemical Breakthrough Award from the Division of History of Chemistry of the American Chemical Society in 2017.[83][1]

At the core of the PCR method is the use of a suitable DNA polymerase able to withstand the high temperatures of >90 °C (194 °F) required for separation of the two DNA strands in the DNA double helix after each replication cycle. The DNA polymerases initially employed for in vitro experiments presaging PCR were unable to withstand these high temperatures.[1] So the early procedures for DNA replication were very inefficient and time-consuming, and required large amounts of DNA polymerase and continuous handling throughout the process.

The discovery in 1976 of Taq polymerase—a DNA polymerase purified from the thermophilic bacterium, Thermus aquaticus, which naturally lives in hot (50 to 80 °C (122 to 176 °F)) environments[13] such as hot springs—paved the way for dramatic improvements of the PCR method. The DNA polymerase isolated from T. aquaticus is stable at high temperatures remaining active even after DNA denaturation,[14] thus obviating the need to add new DNA polymerase after each cycle.[2] This allowed an automated thermocycler-based process for DNA amplification.

Patent disputes[edit]

The PCR technique was patented by Kary Mullis and assigned to Cetus Corporation, where Mullis worked when he invented the technique in 1983. The Taq polymerase enzyme was also covered by patents. There have been several high-profile lawsuits related to the technique, including an unsuccessful lawsuit brought by DuPont. The Swiss pharmaceutical company Hoffmann-La Roche purchased the rights to the patents in 1992 and currently[when?] holds those that are still protected.

A related patent battle over the Taq polymerase enzyme is still ongoing in several jurisdictions around the world between Roche and Promega. The legal arguments have extended beyond the lives of the original PCR and Taq polymerase patents, which expired on March 28, 2005.[84]

See also[edit]

  • COVID-19 testing
  • DNA spiking
  • Loop-mediated isothermal amplification
  • Selector-technique

References[edit]

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