La interferencia de ARN ( ARNi ) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN participan en la supresión específica de secuencia de la expresión génica mediante ARN bicatenario, mediante la traducción o la represión transcripcional. Históricamente, el ARNi se conocía con otros nombres, incluida la cosupresión , el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) y la extinción . El estudio detallado de cada uno de estos procesos aparentemente diferentes aclaró que la identidad de estos fenómenos eran en realidad ARNi. Andrew Fire y Craig C. Mello compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2006 por su trabajo sobre la interferencia del ARN en el nematodo.gusano Caenorhabditis elegans , que publicaron en 1998. Desde el descubrimiento de RNAi y sus potenciales reguladores, se ha hecho evidente que RNAi tiene un inmenso potencial en la supresión de genes deseados. El ARNi se conoce ahora como preciso, eficiente, estable y mejor que la terapia antisentido para la supresión de genes. [1] El ARN antisentido producido intracelularmente por un vector de expresión puede desarrollarse y encontrar utilidad como nuevos agentes terapéuticos. [2]
Dos tipos de moléculas pequeñas de ácido ribonucleico (ARN), microARN (miARN) y ARN pequeño de interferencia ( ARNip ), son fundamentales para la interferencia del ARN. Los ARN son productos directos de los genes, y estos pequeños ARN pueden dirigir complejos enzimáticos para degradar las moléculas de ARN mensajero (ARNm) y, por lo tanto, disminuir su actividad al evitar la traducción mediante el silenciamiento de genes postranscripcional. Además, la transcripción puede inhibirse mediante el mecanismo de silenciamiento pretranscripcional de la interferencia del ARN, a través del cual un complejo enzimático cataliza la metilación del ADN en posiciones genómicas complementarias al ARNip o miARN complejado. La interferencia del ARN tiene un papel importante en la defensa de las células contra las secuencias de nucleótidos parásitos : virus y transposones . También influye en el desarrollo .
La vía de RNAi se encuentra en muchos eucariotas , incluyendo animales, y se inicia por la enzima Dicer , que escinde largas de ARN bicatenario (dsRNA) moléculas en fragmentos bicatenarios cortos de ~ 21 nucleótidos siRNAs . Cada ARNip se desenrolla en dos ARN monocatenarios (ARNss), la hebra pasajera y la hebra guía. La hebra pasajera se degrada y la hebra guía se incorpora al complejo silenciador inducido por ARN (RISC). El resultado mejor estudiado es el silenciamiento génico postranscripcional, que ocurre cuando la hebra guía se empareja con una secuencia complementaria en una molécula de ARN mensajero e induce la escisión por Argonaute 2 (Ago2), el componente catalítico del RISC . En algunos organismos, este proceso se propaga sistémicamente, a pesar de las concentraciones molares inicialmente limitadas de ARNip .
El ARNi es una valiosa herramienta de investigación, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos , porque el ARNdc sintético introducido en las células puede inducir de manera selectiva y robusta la supresión de genes específicos de interés. El ARNi puede usarse para pantallas a gran escala que apagan sistemáticamente cada gen en la célula, lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular particular o un evento como la división celular . La vía también se utiliza como herramienta práctica en biotecnología , medicina e insecticidas . [3]
Mecanismo celular
El ARNi es un proceso de silenciamiento génico dependiente de ARN que está controlado por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y se inicia mediante moléculas de ARN bicatenarias cortas en el citoplasma de una célula, donde interactúan con el componente catalítico RISC argonauta . [5] Cuando el dsRNA es exógeno (procedente de la infección por un virus con un genoma de RNA o manipulaciones de laboratorio), el RNA se importa directamente al citoplasma y Dicer lo escinde en fragmentos cortos. El dsRNA iniciador también puede ser endógeno (originado en la célula), como en los pre-microRNAs expresados a partir de genes codificantes de RNA en el genoma. Las transcripciones primarias de tales genes se procesan primero para formar la estructura de tallo-bucle característica del pre-miARN en el núcleo , luego se exportan al citoplasma. Por tanto, las dos rutas de dsRNA, exógena y endógena, convergen en el RISC. [6]
El dsRNA exógeno inicia el RNAi mediante la activación de la proteína ribonucleasa Dicer, [7] que se une y escinde los RNA bicatenarios (dsRNA) en plantas, o los RNA en horquilla cortos (shRNA) en humanos, para producir fragmentos bicatenarios de 20-25 pares de bases con un saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3 '. [8] Los estudios bioinformáticos sobre los genomas de múltiples organismos sugieren que esta longitud maximiza la especificidad del gen diana y minimiza los efectos no específicos. [9] Estos fragmentos cortos de doble hebra se denominan ARN de interferencia pequeños ( ARNip ). A continuación, estos ARNip se separan en cadenas simples y se integran en un RISC activo mediante el complejo de carga de RISC (RLC). RLC incluye Dicer-2 y R2D2, y es crucial para unir Ago2 y RISC. [10] El factor 11 asociado a la proteína de unión a TATA (TAF11) ensambla el RLC facilitando la tetramerización de Dcr-2-R2D2, lo que aumenta la afinidad de unión al ARNip en 10 veces. La asociación con TAF11 convertiría el complejo R2-D2-Initiator (RDI) en el RLC. [11] R2D2 lleva dominios de unión de ARN bicatenarios en tándem para reconocer el extremo termodinámicamente estable de los dúplex de ARNip , mientras que Dicer-2 es el otro extremo menos estable. La carga es asimétrica: el dominio MID de Ago2 reconoce el extremo termodinámicamente estable del ARNip. Por lo tanto, la hebra "pasajero" (sentido) cuyo extremo 5 'es descartado por MID es expulsada, mientras que la hebra "guía" guardada (antisentido) coopera con AGO para formar el RISC. [10]
Después de la integración en el RISC, los ARNip se emparejan con su ARNm objetivo y lo escinden, evitando así que se utilice como plantilla de traducción . [12] A diferencia del ARNip , un complejo RISC cargado de miARN explora los ARNm citoplásmicos en busca de complementariedad potencial. En lugar de la escisión destructiva (por Ago2), los miRNA se dirigen más bien a las regiones de la región no traducida (UTR) 3 'de los mRNA donde normalmente se unen con complementariedad imperfecta, bloqueando así el acceso de los ribosomas para la traducción. [13]
El dsRNA exógeno es detectado y unido por una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de dicer. [14] Se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud y esta proteína solo se une a ARNds largos. [14]
En C. elegans esta respuesta iniciación se amplifica a través de la síntesis de una población de 'secundarios' siRNAs durante el cual el dicer-producido iniciar o 'primaria' siRNAs se utilizan como plantillas. [15] Estos ARNip 'secundarios' son estructuralmente distintos de los ARNip producidos por dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). [16] [17]
MicroARN
Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente que ayudan a regular la expresión génica , particularmente durante el desarrollo . [18] El fenómeno de la interferencia del ARN, ampliamente definido, incluye los efectos de silenciamiento de genes inducidos endógenamente de los miARN, así como el silenciamiento provocado por ARNdc extraño. Los miRNA maduros son estructuralmente similares a los siRNA producidos a partir de dsRNA exógeno, pero antes de alcanzar la madurez, los miRNA primero deben someterse a una extensa modificación postranscripcional . Un miARN se expresa a partir de un gen codificante de ARN mucho más largo como una transcripción primaria conocida como pri-miARN que se procesa, en el núcleo celular , en una estructura de bucle madre de 70 nucleótidos llamada pre-miARN por el complejo microprocesador . Este complejo consta de una enzima RNasa III llamada Drosha y una proteína de unión a dsRNA DGCR8 . Dicer une y escinde la porción de ARNdc de este pre-miARN para producir la molécula de miARN madura que puede integrarse en el complejo RISC; por tanto, miRNA y siRNA comparten la misma maquinaria celular corriente abajo. [19] En primer lugar, se describió el miARN codificado por virus en el virus de Epstein-Barr (EBV). [20] A partir de entonces, se ha descrito un número creciente de microARN en virus. VIRmiRNA es un catálogo completo que cubre los microARN virales, sus objetivos y los miARN antivirales [21] (véase también el recurso VIRmiRNA: http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/).
Los ARNip derivados de precursores de ARNdc largos difieren de los miARN en que los miARN, especialmente los de animales, tienen típicamente un apareamiento de bases incompleto con una diana e inhiben la traducción de muchos ARNm diferentes con secuencias similares. Por el contrario, los ARNip típicamente se emparejan perfectamente e inducen la escisión del ARNm solo en una única diana específica. [22] En Drosophila y C. elegans , miRNA y siRNA son procesados por distintas proteínas argonauta y enzimas dicer. [23] [24]
Tres regiones primarias sin traducir y microARN
Tres regiones primarias no traducidas (3'UTR) de ARN mensajero (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que causan interferencia de ARN postranscripcionalmente. Tales 3'-UTR a menudo contienen sitios de unión tanto para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación del transcrito. El 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.
El 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta de microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los miARN. Estos son motivos prevalentes dentro de 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.
A partir de 2014, el sitio web miRBase , [25] un archivo de secuencias y anotaciones de miARN , enumeró 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estos, 1.881 miARN estaban en loci de miARN humanos anotados. Se predijo que los miARN tenían un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (que afectaban la expresión de varios cientos de genes). [26] Friedman y col. [26] estiman que> 45.000 sitios diana de miARN dentro de las 3'UTR de ARNm humano se conservan por encima de los niveles de fondo, y> 60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el apareamiento con los miARN.
Los experimentos directos muestran que un solo miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de mRNA únicos. [27] Otros experimentos muestran que un solo miARN puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos del doble). [28] [29]
Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN parecen ser importantes en el cáncer. [30] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, nueve miARN han sido identificados como alterados epigenéticamente y efectivos para regular a la baja las enzimas reparadoras del ADN. [31]
Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miARN también parecen ser importantes en los trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [32] [33] [34]
Activación y catálisis de RISC
El dsRNA exógeno es detectado y unido por una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de dicer. [14] Esta proteína solo se une a ARNds largos, pero se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud. [14] Esta proteína de unión a ARN facilita la transferencia de ARNip escindidos al complejo RISC. [35]
En C. elegans esta respuesta iniciación se amplifica a través de la síntesis de una población de 'secundarios' siRNAs durante el cual el dicer-producido iniciar o 'primaria' siRNAs se utilizan como plantillas. [15] Estos ARNip 'secundarios' son estructuralmente distintos de los ARNip producidos por dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). [16] [17]
Los componentes activos de un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) son endonucleasas llamadas proteínas argonauta, que escinden la hebra de ARNm diana complementaria a su ARNip unido . [5] Como los fragmentos producidos por el dicer son de doble hebra, cada uno de ellos podría, en teoría, producir un ARNip funcional . Sin embargo, solo una de las dos hebras, que se conoce como hebra guía , se une a la proteína argonauta y dirige el silenciamiento génico. La otra hebra anti-guía o hebra pasajera se degrada durante la activación de RISC. [36] Aunque se creía en primer lugar que un ATP dependiente de helicasa separa estos dos hebras, [37] el proceso resultó ser independiente de ATP y realizado directamente por los componentes proteicos de RISC. [38] [39] Sin embargo, un análisis cinético in vitro de ARNi en presencia y ausencia de ATP mostró que se puede requerir ATP para desenrollar y eliminar la hebra de ARNm escindida del complejo RISC después de la catálisis. [40] La hebra guía tiende a ser aquella cuyo extremo 5 ' está emparejado de forma menos estable con su complemento, [41] pero la selección de la hebra no se ve afectada por la dirección en la que el dicer corta el dsRNA antes de la incorporación de RISC. [42] En cambio, la proteína R2D2 puede servir como factor de diferenciación al unirse al extremo 5 'más estable de la hebra pasajera. [43]
La base estructural para la unión de ARN a la proteína argonauta se examinó mediante cristalografía de rayos X del dominio de unión de una proteína argonauta unida a ARN. Aquí, el extremo 5 ' fosforilado de la cadena de ARN entra en un bolsillo de la superficie básica conservada y hace contactos a través de un catión divalente (un átomo con dos cargas positivas) como el magnesio y por apilamiento aromático (un proceso que permite que más de un átomo comparta un electrón pasándolo de un lado a otro) entre el nucleótido 5 'en el ARNip y un residuo de tirosina conservado . Se cree que este sitio forma un sitio de nucleación para la unión del ARNip a su ARNm diana. [44] El análisis del efecto inhibidor de los desajustes en el extremo 5 'o 3' de la hebra guía ha demostrado que el extremo 5 'de la hebra guía es probablemente responsable de emparejar y unir el ARNm diana, mientras que el extremo 3' es responsable de disponer físicamente el ARNm diana en una región RISC favorable a la escisión. [40]
No se comprende cómo el complejo RISC activado localiza ARNm complementarios dentro de la célula. Aunque se ha propuesto que el proceso de escisión está ligado a la traducción , la traducción del ARNm diana no es esencial para la degradación mediada por ARNi. [45] De hecho, el ARNi puede ser más eficaz contra dianas de ARNm que no se traducen. [46] Las proteínas argonauta se localizan en regiones específicas del citoplasma llamadas cuerpos P (también cuerpos citoplasmáticos o cuerpos GW), que son regiones con altas tasas de descomposición del ARNm; [47] La actividad de miARN también se agrupa en cuerpos P. [48] La alteración de los cuerpos P disminuye la eficiencia de la interferencia del ARN, lo que sugiere que son un sitio crítico en el proceso de ARNi. [49]
Silenciamiento transcripcional
Los componentes de la vía del ARNi se utilizan en muchos eucariotas para el mantenimiento de la organización y estructura de sus genomas . La modificación de histonas y la inducción asociada de la formación de heterocromatina sirven para regular a la baja los genes pre- transcripcionalmente ; [51] este proceso se conoce como silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS) y es llevado a cabo por un complejo de proteínas llamado complejo RITS. En la levadura de fisión, este complejo contiene argonauta, una proteína de cromodominio Chp1 y una proteína llamada Tas3 de función desconocida. [52] Como consecuencia, la inducción y propagación de regiones heterocromáticas requiere las proteínas argonauta y RdRP. [53] De hecho, la deleción de estos genes en la levadura de fisión S. pombe interrumpe la metilación de histonas y la formación de centrómeros , [54] causando anafase lenta o estancada durante la división celular . [55] En algunos casos, se ha observado que procesos similares asociados con la modificación de histonas regulan positivamente la transcripción de los genes. [56]
El mecanismo por el cual el complejo RITS induce la formación y organización de heterocromatina no se comprende bien. La mayoría de los estudios se han centrado en la región de tipo de apareamiento en la levadura de fisión, que puede no ser representativa de las actividades en otras regiones / organismos genómicos. En el mantenimiento de las regiones de heterocromatina existentes, RITS forma un complejo con ARNip complementarios a los genes locales y se une de manera estable a las histonas metiladas locales, actuando co-transcripcionalmente para degradar cualquier transcripción de pre-ARNm naciente que sea iniciada por la ARN polimerasa . La formación de dicha región de heterocromatina, aunque no su mantenimiento, es dependiente de dicer, presumiblemente porque se requiere dicer para generar el complemento inicial de ARNip que se dirigen a transcripciones posteriores. [57] Se ha sugerido que el mantenimiento de la heterocromatina funciona como un bucle de retroalimentación que se autorrefuerza, ya que los nuevos ARNip se forman a partir de transcripciones nacientes ocasionales por RdRP para su incorporación en complejos RITS locales. [58] La relevancia de las observaciones de las regiones de apareamiento de levaduras de fisión y centrómeros para los mamíferos no está clara, ya que el mantenimiento de la heterocromatina en las células de los mamíferos puede ser independiente de los componentes de la vía del ARNi. [59]
Diafonía con edición de ARN
El tipo de edición de ARN que es más frecuente en eucariotas superiores convierte los nucleótidos de adenosina en inosina en los ARNbc a través de la enzima adenosina desaminasa (ADAR). [60] Se propuso originalmente en 2000 que las vías de edición de ARNi y ARN A → I podrían competir por un sustrato común de ARNbc. [61] Algunos pre-miARN se someten a edición de ARN A → I [62] [63] y este mecanismo puede regular el procesamiento y la expresión de miARN maduros. [63] Además, al menos un ADAR de mamífero puede secuestrar ARNip de los componentes de la ruta del ARNi. [64] El apoyo adicional para este modelo proviene de estudios sobre cepas de C. elegans nulas para ADAR que indican que la edición de ARN A → I puede contrarrestar el silenciamiento de RNAi de genes y transgenes endógenos. [sesenta y cinco]
Variación entre organismos
Los organismos varían en su capacidad para absorber dsRNA extraño y utilizarlo en la vía del RNAi. Los efectos de la interferencia del ARN pueden ser tanto sistémicos como hereditarios en plantas y C. elegans , aunque no en Drosophila o mamíferos. En las plantas, se cree que el ARNi se propaga mediante la transferencia de ARNip entre células a través de plasmodesmos (canales en las paredes celulares que permiten la comunicación y el transporte). [37] La heredabilidad proviene de la metilación de promotores dirigidos por ARNi; el nuevo patrón de metilación se copia en cada nueva generación de la célula. [67] Una amplia distinción general entre plantas y animales radica en la selección de miARN producidos de forma endógena; en las plantas, los miARN suelen ser perfecta o casi perfectamente complementarios a sus genes diana e inducen la escisión directa del ARNm por RISC, mientras que los miARN de los animales tienden a ser más divergentes en secuencia e inducen la represión de la traducción. [66] Este efecto de traducción puede producirse inhibiendo las interacciones de los factores de iniciación de la traducción con la cola de poliadenina del ARN mensajero . [68]
Algunos protozoos eucariotas como Leishmania major y Trypanosoma cruzi carecen por completo de la vía del ARNi. [69] [70] La mayoría o todos los componentes también faltan en algunos hongos , sobre todo en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae . [71] La presencia de ARNi en otras especies de levaduras en ciernes como Saccharomyces castellii y Candida albicans , demuestra además que la inducción de dos proteínas relacionadas con ARNi de S. castellii facilita el ARNi en S. cerevisiae . [72] El hecho de que a ciertos ascomicetos y basidiomicetos les falten vías de interferencia de ARN indica que las proteínas necesarias para el silenciamiento del ARN se han perdido independientemente de muchos linajes de hongos , posiblemente debido a la evolución de una vía nueva con función similar, o a la falta de ventaja selectiva en ciertos nichos . [73]
Sistemas procariotas relacionados
La expresión génica en procariotas está influenciada por un sistema basado en ARN similar en algunos aspectos al ARNi. Aquí, los genes que codifican el ARN controlan la abundancia o traducción del ARNm mediante la producción de un ARN complementario que se hibrida con un ARNm. Sin embargo, estos ARN reguladores generalmente no se consideran análogos a los miARN porque la enzima dicer no está involucrada. [74] Se ha sugerido que los sistemas de interferencia CRISPR en procariotas son análogos a los sistemas de interferencia de ARN eucariotas, aunque ninguno de los componentes proteicos es ortólogo . [75]
Funciones biologicas
Inmunidad
La interferencia del ARN es una parte vital de la respuesta inmune a virus y otro material genético extraño , especialmente en plantas donde también puede prevenir la autopropagación de transposones. [76] Plantas como Arabidopsis thaliana expresan múltiples homólogos de dicer que están especializados para reaccionar de manera diferente cuando la planta se expone a diferentes virus. [77] Incluso antes de que se entendiera por completo la vía del ARNi, se sabía que el silenciamiento de genes inducido en plantas podría extenderse por toda la planta con un efecto sistémico y podría transferirse de las plantas madre a los vástagos mediante injertos . [78] Desde entonces, este fenómeno ha sido reconocido como una característica del sistema inmunológico adaptativo de la planta y permite que toda la planta responda a un virus después de un encuentro localizado inicial. [79] En respuesta, muchos virus de plantas han desarrollado elaborados mecanismos para suprimir la respuesta de ARNi. [80] Estas incluyen proteínas virales que se unen a fragmentos cortos de ARN de doble hebra con extremos que sobresalen de una hebra, como los que produce el dicer. [81] Algunos genomas de plantas también expresan ARNip endógenos en respuesta a la infección por tipos específicos de bacterias . [82] Estos efectos pueden ser parte de una respuesta generalizada a los patógenos que regula a la baja cualquier proceso metabólico en el huésped que ayude al proceso de infección. [83]
Aunque los animales generalmente expresan menos variantes de la enzima dicer que las plantas, el ARNi en algunos animales produce una respuesta antiviral. En tanto juveniles y adultos de Drosophila , ARN de interferencia es importante en antiviral inmunidad innata y es activa contra los patógenos tales como virus de Drosophila X . [84] [85] Un papel similar en la inmunidad puede operar en C. elegans , ya que las proteínas argonauta se regulan positivamente en respuesta a virus y gusanos que sobreexpresan componentes de la vía del ARNi son resistentes a la infección viral. [86] [87]
El papel de la interferencia del ARN en la inmunidad innata de los mamíferos es poco conocido y hay relativamente pocos datos disponibles. Sin embargo, la existencia de virus que codifican genes capaces de suprimir la respuesta de ARNi en células de mamíferos puede ser una evidencia a favor de una respuesta inmune de mamíferos dependiente de ARNi, [88] [89] aunque esta hipótesis ha sido cuestionada por estar pobremente fundamentada. [90] Se ha presentado evidencia de la existencia de una vía de ARNi antiviral funcional en células de mamíferos. [91] [92]
También existen otras funciones para el ARNi en virus de mamíferos, como los miARN expresados por el virus del herpes que pueden actuar como desencadenantes de la organización de heterocromatina para mediar la latencia viral. [93]
Regulación negativa de genes
Los miARN expresados endógenamente, incluidos los miARN intrónicos e intergénicos , son más importantes en la represión traduccional [66] y en la regulación del desarrollo, especialmente en el momento de la morfogénesis y el mantenimiento de tipos de células indiferenciadas o incompletamente diferenciadas, como las células madre . [94] El papel del miARN expresado de forma endógena en la regulación a la baja de la expresión génica se describió por primera vez en C. elegans en 1993. [95] En las plantas, esta función se descubrió cuando se demostró que el "microARN JAW" de Arabidopsis estaba involucrado en la regulación de varios genes que controlan la forma de la planta. [96] En las plantas, la mayoría de los genes regulados por miARN son factores de transcripción ; [97] por lo tanto, la actividad de miARN es particularmente amplia y regula redes de genes completas durante el desarrollo mediante la modulación de la expresión de genes reguladores clave, incluidos los factores de transcripción y las proteínas F-box . [98] En muchos organismos, incluidos los humanos, los miARN están relacionados con la formación de tumores y la desregulación del ciclo celular . Aquí, los miARN pueden funcionar como oncogenes y supresores de tumores . [99]
Evolución
Según el análisis filogenético basado en la parsimonia , el ancestro común más reciente de todos los eucariotas probablemente ya poseía una vía de interferencia de ARN temprana; Se cree que la ausencia de la vía en ciertos eucariotas es una característica derivada. [100] Este sistema de ARNi ancestral probablemente contenía al menos una proteína tipo dicer, un argonauta, una proteína PIWI y una ARN polimerasa dependiente de ARN que también puede haber desempeñado otras funciones celulares. Un estudio de genómica comparativa a gran escala también indica que el grupo de la corona eucariota ya poseía estos componentes, que luego pueden haber tenido asociaciones funcionales más estrechas con sistemas de degradación de ARN generalizados como el exosoma . [101] Este estudio también sugiere que la familia de proteínas argonauta de unión al ARN, que se comparte entre los eucariotas, la mayoría de las arqueas y al menos algunas bacterias (como Aquifex aeolicus ), es homóloga y originalmente evolucionó a partir de componentes del sistema de iniciación de la traducción. .
Aplicaciones
Derribo de genes
La vía de interferencia del ARN a menudo se explota en biología experimental para estudiar la función de genes en cultivos celulares e in vivo en organismos modelo . [5] El ARN bicatenario se sintetiza con una secuencia complementaria a un gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético exógeno y activa la vía del ARNi. Usando este mecanismo, los investigadores pueden causar una disminución drástica en la expresión de un gen objetivo. El estudio de los efectos de esta disminución puede mostrar el papel fisiológico del producto génico. Dado que el ARNi puede no abolir totalmente la expresión del gen, esta técnica a veces se denomina " knockdown ", para distinguirla de los procedimientos " knockout " en los que la expresión de un gen se elimina por completo. [102] En un estudio reciente, la validación de la eficiencia de silenciamiento de ARNi utilizando datos de matriz de genes mostró una tasa de falla del 18,5% en 429 experimentos independientes. [103]
Se han dirigido extensos esfuerzos en biología computacional hacia el diseño de reactivos de ARNdc exitosos que maximizan la eliminación de genes pero minimizan los efectos "fuera del objetivo". Los efectos fuera del objetivo surgen cuando un ARN introducido tiene una secuencia de bases que puede emparejarse y, por lo tanto, reducir la expresión de múltiples genes. Estos problemas ocurren con mayor frecuencia cuando el dsRNA contiene secuencias repetitivas. Se ha estimado a partir del estudio de los genomas de humanos, C. elegans y S. pombe que alrededor del 10% de los posibles ARNip tienen efectos sustanciales fuera del objetivo. [9] Se han desarrollado una multitud de herramientas de software que implementan algoritmos para el diseño de ARNip generales [104] [105] específicos de mamíferos, [106] y específicos de virus [107] que se comprueban automáticamente para detectar una posible reactividad cruzada.
Dependiendo del organismo y del sistema experimental, el ARN exógeno puede ser una cadena larga diseñada para ser escindida por un cortador, o ARN cortos diseñados para servir como sustratos de ARNip . En la mayoría de las células de mamíferos, se utilizan ARN más cortos porque las moléculas largas de ARN de doble hebra inducen la respuesta al interferón de los mamíferos , una forma de inmunidad innata que reacciona de forma inespecífica al material genético extraño. [108] Los ovocitos de ratón y las células de los primeros embriones de ratón carecen de esta reacción al dsRNA exógeno y, por lo tanto, son un sistema modelo común para estudiar los efectos de eliminación de genes en mamíferos. [109] También se han desarrollado técnicas de laboratorio especializadas para mejorar la utilidad de RNAi en sistemas de mamíferos evitando la introducción directa de siRNA , por ejemplo, mediante transfección estable con un plásmido que codifica la secuencia apropiada a partir de la cual se pueden transcribir los siRNA , [110] o mediante sistemas de vectores lentivirales más elaborados que permiten la activación o desactivación inducible de la transcripción, conocida como ARNi condicional . [111] [112]
Genómica funcional
Los enfoques para el diseño de bibliotecas de ARNi de todo el genoma pueden requerir más sofisticación que el diseño de un solo ARNip para un conjunto definido de condiciones experimentales. Las redes neuronales artificiales se utilizan con frecuencia para diseñar bibliotecas de ARNip [113] y para predecir su probable eficacia en la eliminación de genes. [114] El cribado genómico masivo se considera en general un método prometedor para la anotación del genoma y ha desencadenado el desarrollo de métodos de cribado de alto rendimiento basados en microarrays . [115] [116] Sin embargo, se ha cuestionado la utilidad de estas pantallas y la capacidad de las técnicas desarrolladas en organismos modelo para generalizar incluso a especies estrechamente relacionadas, por ejemplo, de C. elegans a nematodos parásitos relacionados. [117] [118]
Medicamento
Historia del uso de RNAi en medicina
El primer caso de silenciamiento de ARN en animales se documentó en 1996, cuando Guo y Kemphues observaron que, al introducir ARN sentido y antisentido en el ARN par-1 en Caenorhabditis elegans, se producía la degradación del mensaje par-1. [119] Se pensaba que esta degradación era provocada por ARN monocatenario (ssRNA), pero dos años más tarde, en 1998, Fire y Mello descubrieron que esta capacidad para silenciar la expresión del gen par-1 en realidad era provocada por doble cadena ARN (dsRNA). [119] Eventualmente compartirían el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por este descubrimiento. [120] Justo después del innovador descubrimiento de Fire y Mello, Elbashir et al. Descubrió que, mediante el uso de ARN de interferencia pequeño (ARNip) elaborado sintéticamente , era posible apuntar al silenciamiento de secuencias específicas en un gen, en lugar de silenciar el gen completo. [121] Solo un año después, McCaffrey y sus colegas demostraron que este silenciamiento específico de secuencia tenía aplicaciones terapéuticas al dirigirse a una secuencia del virus de la hepatitis C en ratones transgénicos . [122] Desde entonces, varios investigadores han intentado expandir las aplicaciones terapéuticas de RNAi, buscando específicamente genes que causan varios tipos de cáncer . [123] [124] En 2006, las primeras aplicaciones que llegaron a los ensayos clínicos fueron en el tratamiento de la degeneración macular y el virus sincitial respiratorio . [125] Cuatro años más tarde se inició el primer ensayo clínico de Fase I en humanos, utilizando un sistema de administración de nanopartículas para atacar tumores sólidos . [126] Aunque la mayor parte de la investigación está estudiando actualmente las aplicaciones de ARNi en el tratamiento del cáncer, la lista de posibles aplicaciones es extensa. El ARNi podría potencialmente usarse para tratar virus , [127] enfermedades bacterianas , [128] parásitos , [129] mutaciones genéticas desadaptativas , [130] controlar el consumo de drogas , [131] proporcionar alivio del dolor , [132] e incluso modular el sueño. [133]
Aplicaciones Terapéuticas
Infección viral
El tratamiento antiviral es una de las primeras aplicaciones médicas propuestas basadas en ARNi, y se han desarrollado dos tipos diferentes. El primer tipo es apuntar a los ARN virales. Muchos estudios han demostrado que los ARN virales dirigidos pueden suprimir la replicación de numerosos virus, incluidos el VIH , [134] VPH , [135] hepatitis A , [136] hepatitis B , [137] virus de la influenza , [138] [139] [140 ] [141] virus respiratorio sincitial (VSR), [141] coronavirus del SARS (SARS-CoV), [141] adenovirus [141] y virus del sarampión . [142] La otra estrategia es bloquear las entradas virales iniciales dirigiéndose a los genes de la célula huésped. [143] Por ejemplo, la supresión de los receptores de quimiocinas ( CXCR4 y CCR5 ) en las células huésped puede prevenir la entrada del virus del VIH. [144]
Cáncer
Si bien la quimioterapia tradicional puede eliminar eficazmente las células cancerosas, la falta de especificidad para discriminar las células normales y las cancerosas en estos tratamientos suele causar efectos secundarios graves. Numerosos estudios han demostrado que el ARNi puede proporcionar un enfoque más específico para inhibir el crecimiento tumoral al dirigirse a genes relacionados con el cáncer (es decir, oncogén ). [145] También se ha propuesto que el ARNi puede mejorar la sensibilidad de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos , proporcionando un enfoque terapéutico combinatorio con la quimioterapia. [146] Otro tratamiento potencial basado en ARNi es inhibir la invasión y migración celular . [147]
Enfermedades neurologicas
Las estrategias de ARNi también muestran potencial para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas . Los estudios en células y en ratones han demostrado que dirigirse específicamente a genes productores de beta amiloide (por ejemplo, BACE1 y APP) por ARNi puede reducir significativamente la cantidad de péptido Aβ que se correlaciona con la causa de la enfermedad de Alzheimer . [148] [149] [150] Además, este enfoques también proporcionar resultados prometedores en el tratamiento de-basado silenciamiento enfermedad de Parkinson y enfermedad de poliglutamina . [151] [152] [153]
Dificultades en la aplicación terapéutica.
Para lograr el potencial clínico del ARNi, el ARNip debe transportarse de manera eficiente a las células de los tejidos diana. Sin embargo, hay varias barreras que se deben arreglar antes de que se pueda usar clínicamente. Por ejemplo, el ARNip "desnudo" es susceptible a varios obstáculos que reducen su eficacia terapéutica. [154] Además, una vez que el ARNip ha entrado en el torrente sanguíneo, las nucleasas séricas pueden degradar el ARN desnudo y estimular el sistema inmunitario innato. [154] Debido a su tamaño y naturaleza altamente polianiónica (que contiene cargas negativas en varios sitios), las moléculas de ARNip sin modificar no pueden ingresar fácilmente a las células a través de la membrana celular. Por lo tanto, se debe utilizar ARNip encapsulado en nanopartículas o artificial . Sin embargo, el transporte de ARNip a través de la membrana celular todavía tiene sus propios desafíos únicos. Si el ARNip se transfiere a través de la membrana celular, pueden producirse toxicidades no deseadas si las dosis terapéuticas no se optimizan, y los ARNip pueden exhibir efectos fuera del objetivo (por ejemplo, regulación negativa involuntaria de genes con complementariedad de secuencia parcial ). [155] Incluso después de ingresar a las células, se requieren dosis repetidas ya que sus efectos se diluyen en cada división celular. Como se describió anteriormente, partes del vector que transporta dsRNA también pueden tener efectos reguladores. Por lo tanto, se deben considerar y controlar los efectos secundarios inespecíficos. [156]
Tratamiento para el cáncer
En comparación con la quimioterapia u otros medicamentos contra el cáncer, existen muchas ventajas del medicamento ARNip. [157] SiRNA actúa en la etapa postranscripcional de la expresión génica, por lo que no modifica ni cambia el ADN en un efecto deletéreo. [157] SiRNA también se puede utilizar para producir una respuesta específica de un cierto tipo de forma, como degradando la supresión de la expresión génica. [157] En una sola célula cancerosa, el ARNip puede causar una supresión dramática de la expresión génica con solo varias copias. [157] Esto sucede al silenciar los genes que promueven el cáncer con ARNi, así como dirigirse a una secuencia de ARNm. [157]
Los medicamentos de ARNi tratan el cáncer silenciando ciertos genes promotores del cáncer. [157] Esto se hace complementando los genes del cáncer con el ARNi, por ejemplo, manteniendo las secuencias del ARNm de acuerdo con el fármaco ARNi. [157] Idealmente, el ARNi debería inyectarse y / o modificarse químicamente para que el ARNi pueda llegar a las células cancerosas de manera más eficiente. [157] Los riñones controlan la captación y regulación de RNAi. [157]
Estimulación de la respuesta inmune.
El sistema inmunológico humano se divide en dos ramas separadas: el sistema inmunológico innato y el sistema inmunológico adaptativo. [158] El sistema inmunológico innato es la primera defensa contra la infección y responde a los patógenos de forma genérica. [158] Por otro lado, el sistema inmunológico adaptativo, un sistema que se desarrolló más tarde que el innato, está compuesto principalmente de células B y T altamente especializadas que están entrenadas para reaccionar a porciones específicas de moléculas patógenas. [158]
El desafío entre patógenos antiguos y nuevos ha ayudado a crear un sistema de células y partículas protegidas que se denominan marco seguro. [158] Este marco le ha dado a los humanos un ejército de sistemas que buscan y destruyen partículas invasoras, como patógenos, organismos microscópicos, parásitos e infecciones. [158] El marco de seguridad para mamíferos se ha desarrollado para incorporar ARNip como una herramienta para indicar contaminación viral, lo que ha permitido que ARNsi genere una intensa respuesta inmune innata. [158]
El ARNip está controlado por el sistema inmunológico innato, que se puede dividir en respuestas inflamatorias agudas y respuestas antivirales. [158] La respuesta inflamatoria se crea con señales de pequeñas moléculas de señalización o citocinas. [158] Estos incluyen interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α). [158] El sistema inmunológico innato genera inflamación y respuestas antivirales, que provocan la liberación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). [158] Estos receptores ayudan a identificar qué patógenos son virus, hongos o bacterias. [158] Además, la importancia del ARNip y del sistema inmunológico innato es incluir más PRR para ayudar a reconocer diferentes estructuras de ARN. [158] Esto hace que sea más probable que el ARNip provoque una respuesta inmunoestimulante en caso del patógeno. [158]
Las perspectivas como técnica terapéutica
Los estudios clínicos de fase I y II de terapias de ARNip realizados entre 2015 y 2017 han demostrado una potente y duradera destrucción de genes en el hígado , con algunos signos de mejoría clínica y sin una toxicidad inaceptable. [155] Se están realizando dos estudios de fase III para tratar los síndromes cardíacos y neurodegenerativos familiares causados por mutaciones en la transtiretina (TTR). [155] Numerosas publicaciones han demostrado que los sistemas de administración in vivo son muy prometedores y tienen características diversas, lo que permite numerosas aplicaciones. El sistema de administración de nanopartículas es el más prometedor, pero este método presenta desafíos adicionales en la ampliación del proceso de fabricación, como la necesidad de procesos de mezcla estrictamente controlados para lograr una calidad constante del producto farmacéutico. [154]
La siguiente tabla muestra diferentes fármacos que utilizan la interferencia de ARN y cuáles fueron sus fases y estado en los ensayos clínicos a partir de 2013. [154]
Droga | Objetivo | Sistema de entrega | Enfermedad | Fase | Estado | Empresa | Identificador |
ALN – VSP02 | KSP y VEGF | LNP | Tumores sólidos | I | Terminado | Productos farmacéuticos de Alnylam | NCT01158079 |
ARNip – EphA2 – DOPC | EphA2 | LNP | Cánceres avanzados | I | Reclutamiento | MD Anderson Cancer Center | NCT01591356 |
Atu027 | PKN3 | LNP | Tumores sólidos | I | Terminado | Terapéutica del silencio | NCT00938574 |
TKM – 080301 | PLK1 | LNP | Cáncer | I | Reclutamiento | Farmacéutica Tekmira | NCT01262235 |
TKM – 100201 | VP24, VP35, Zaire Ebola L-polimerasa | LNP | Infección por el virus del Ébola | I | Reclutamiento | Farmacéutica Tekmira | NCT01518881 |
ALN – RSV01 | Nucleocápside de RSV | ARNip desnudo | Infecciones por virus respiratorio sincitial | II | Terminado | Productos farmacéuticos de Alnylam | NCT00658086 |
PRO-040201 | ApoB | LNP | Hipercolesterolemia | I | Terminado | Farmacéutica Tekmira | NCT00927459 |
ALN – PCS02 | PCSK9 | LNP | Hipercolesterolemia | I | Terminado | Productos farmacéuticos de Alnylam | NCT01437059 |
ALN – TTR02 | TTR | LNP | Amiloidosis mediada por transtiretina | II | Reclutamiento | Productos farmacéuticos de Alnylam | NCT01617967 |
CALAA-01 | RRM2 | Ciclodextrina NP | Tumores sólidos | I | Activo | Calando Pharmaceuticals | NCT00689065 |
TD101 | K6a (mutación N171K) | ARNip desnudo | Paquioniquia congénita | I | Terminado | Proyecto Paquioniquia Congénita | NCT00716014 |
AGN211745 | VEGFR1 | ARNip desnudo | Degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización coroidea | II | Terminado | Allergan | NCT00395057 |
QPI-1007 | CASP2 | ARNip desnudo | Atrofia óptica, neuropatía óptica isquémica anterior no arterítica | I | Terminado | Productos farmacéuticos de Quark | NCT01064505 |
I5NP | p53 | ARNip desnudo | Lesión renal, insuficiencia renal aguda | I | Terminado | Productos farmacéuticos de Quark | NCT00554359 |
Función retardada del injerto, complicaciones del trasplante de riñón | Yo, yo | Reclutamiento | Productos farmacéuticos de Quark | NCT00802347 | |||
PF-655 (PF-04523655) | RTP801 (objetivo propietario) | ARNip desnudo | Neovascularización coroidea, retinopatía diabética, edema macular diabético | II | Activo | Productos farmacéuticos de Quark | NCT01445899 |
SIG12D LODER | KRAS | Polímero LODER | Cáncer de páncreas | II | Reclutamiento | Silenciado | NCT01676259 |
Bevasiranib | VEGF | ARNip desnudo | Edema macular diabético, degeneración macular | II | Terminado | Opko Health | NCT00306904 |
SYL1001 | TRPV1 | ARNip desnudo | Dolor ocular, síndrome del ojo seco | Yo, yo | Reclutamiento | Sylentis | NCT01776658 |
SYL040012 | ADRB2 | ARNip desnudo | Hipertensión ocular, glaucoma de ángulo abierto | II | Reclutamiento | Sylentis | NCT01739244 |
CEQ508 | CTNNB1 | ARNhc portador de Escherichia coli | Poliposis adenomatosa familiar | Yo, yo | Reclutamiento | Marina Biotech | Desconocido |
RXi-109 | CTGF | Compuesto de ARNi autoadministrado | Prevención de cicatrices Cicatrix | I | Reclutamiento | Productos farmacéuticos RXi | NCT01780077 |
ALN – TTRsc | TTR | conjugado de ARNip-GalNAc | Amiloidosis mediada por transtiretina | I | Reclutamiento | Productos farmacéuticos de Alnylam | NCT01814839 |
ARC-520 | Regiones conservadas de VHB | DPC | VHB | I | Reclutamiento | Investigación de Arrowhead | NCT01872065 |
Biotecnología
La interferencia de ARN se ha utilizado para aplicaciones en biotecnología y está a punto de comercializarse en otros campos. El ARNi ha dado lugar a la invención de nuevos cultivos como el tabaco sin nicotina, el café descafeinado, la vegetación enriquecida con nutrientes y los cultivos hipoalergénicos. Las manzanas árticas modificadas genéticamente recibieron la aprobación de la FDA en 2015. [159] Las manzanas se produjeron mediante la supresión por ARNi del gen PPO (polifenol oxidasa), lo que produce variedades de manzana que no se oscurecerán después de ser cortadas en rodajas. Las manzanas silenciadas con PPO no pueden convertir el ácido clorogénico en el producto estándar de quinona. [1]
Existen varias oportunidades para las aplicaciones de RNAi en la ciencia de los cultivos para su mejora, como la tolerancia al estrés y el nivel nutricional mejorado. El ARNi demostrará su potencial de inhibición de la fotorrespiración para mejorar la productividad de las plantas C3. Esta tecnología de eliminación puede ser útil para inducir la floración temprana, la maduración retrasada, la senescencia retrasada, romper la latencia, plantas libres de estrés, superar la autoesterilidad, etc. [1]
Alimentos
El ARNi se ha utilizado para diseñar genéticamente plantas que produzcan niveles más bajos de toxinas vegetales naturales. Estas técnicas aprovechan el fenotipo de ARNi estable y hereditario en las reservas de plantas. Algodón semillas son ricas en proteínas de la dieta , pero naturalmente contienen el tóxico terpenoide producto gosipol , que los hace inadecuados para el consumo humano. El ARNi se ha utilizado para producir reservas de algodón cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintasa , una enzima clave en la producción de gosipol, sin afectar la producción de la enzima en otras partes de la planta, donde el gosipol es en sí mismo importante para prevenir el daño causado por las plagas de las plantas. [160] Se han dirigido esfuerzos similares hacia la reducción del producto natural cianogénico linamarina en plantas de yuca . [161]
Ningún producto vegetal que utilice ingeniería genética basada en ARNi ha salido todavía de la etapa experimental. Los esfuerzos de desarrollo han logrado reducir los niveles de alérgenos en las plantas de tomate [162] y la fortificación de plantas como los tomates con antioxidantes dietéticos . [163] Los productos comerciales anteriores, incluido el tomate Flavr Savr y dos cultivares de papaya resistente a las manchas anulares , se desarrollaron originalmente utilizando tecnología antisentido , pero probablemente explotaban la vía del ARNi. [164] [165] El silenciamiento de la alfa-amilasa por ARNi también se ha utilizado para disminuir el crecimiento del hongo Aspergillus flavus en el maíz, que de otro modo habría contaminado los granos con aflatoxinas peligrosas . [166] El silenciamiento del factor lacrimógeno sintasa en las cebollas ha producido cebollas sin lágrimas y se ha utilizado ARNi en los genes BP1 en las semillas de colza para mejorar la fotosíntesis. [167] Los genes SBEIIa y SBEIIb del trigo se han dirigido al trigo para producir niveles más altos de amilosa con el fin de mejorar la función intestinal. [168]
Otros cultivos
Otro esfuerzo redujo los precursores de probables carcinógenos en las plantas de tabaco . [169] Otras características de las plantas que se han diseñado en el laboratorio incluyen la producción de productos naturales no narcóticos por la adormidera [170] y la resistencia a los virus comunes de las plantas. [171]
Insecticida
El ARNi se está desarrollando como insecticida , empleando múltiples enfoques, incluida la ingeniería genética y la aplicación tópica. [3] Las células del intestino medio de algunos insectos absorben las moléculas de ARNdc en el proceso denominado ARNi ambiental. [172] En algunos insectos, el efecto es sistémico, ya que la señal se propaga por todo el cuerpo del insecto (denominado ARNi sistémico). [173]
Los animales expuestos a ARNi en dosis millones de veces más altas que los niveles de exposición humana anticipados no muestran efectos adversos. [174]
El ARNi tiene efectos variables en diferentes especies de lepidópteros (mariposas y polillas). [175] Posiblemente debido a que su saliva y jugo intestinal son mejores para descomponer el ARN, hasta ahora no se ha demostrado que el gusano del algodón , el gusano soldado de la remolacha y el barrenador asiático del arroz sean susceptibles al ARNi al alimentarse. [3]
La evidencia reciente sugiere que la resistencia a RNAi podría ser de amplio espectro, lo que significa que la resistencia a una secuencia podría conferir resistencia a otras secuencias de dsRNA. En una población de laboratorio de gusano de la raíz del maíz occidental, la resistencia se produjo debido a la falta de captación de dsRNA de DvSnf7 a través del intestino. [176] Cuando se probaron otras secuencias de dsRNA contra DvSnf7, las otras secuencias dejaron de ser efectivas, lo que sugiere que el manejo de la resistencia sería más difícil que simplemente cambiar las secuencias de dsRNA. La combinación de múltiples estrategias, como la ingeniería de la proteína Cry, derivada de una bacteria llamada Bacillus thuringiensis (Bt), y RNAi en una planta, retrasa la aparición de la resistencia. [3] [177]
Plantas transgénicas
Se han hecho cultivos transgénicos para expresar dsRNA, cuidadosamente seleccionados para silenciar genes cruciales en plagas objetivo. Estos dsRNA están diseñados para afectar solo a insectos que expresan secuencias de genes específicas. Como prueba de principio , en 2009 un estudio mostró ARN que podrían matar a cualquiera de las cuatro especies de moscas de la fruta sin dañar a las otras tres. [3]
En 2012, Syngenta compró la firma belga de ARNi Devgen por 522 millones de dólares y Monsanto pagó 29,2 millones de dólares por los derechos exclusivos de propiedad intelectual de Alnylam Pharmaceuticals . El Centro Internacional de la Papa en Lima, Perú, está buscando genes para apuntar en el gorgojo de la batata, un escarabajo cuyas larvas arrasan las batatas en todo el mundo. Otros investigadores están tratando de silenciar genes en hormigas, orugas y escarabajos del polen. Es probable que Monsanto sea el primero en comercializar, con una semilla de maíz transgénica que expresa dsRNA basado en el gen Snf7 del gusano de la raíz del maíz occidental , un escarabajo cuyas larvas causan anualmente mil millones de dólares en daños solo en los Estados Unidos. Un artículo de 2012 mostró que silenciar Snf7 frena el crecimiento de las larvas, matándolas en cuestión de días. En 2013, el mismo equipo demostró que el ARN afecta a muy pocas otras especies. [3]
Actual
Alternativamente, el dsRNA se puede suministrar sin ingeniería genética. Un enfoque es agregarlos al agua de riego . Las moléculas son absorbidas por el sistema vascular de las plantas y envenenan a los insectos que se alimentan de ellas. Otro enfoque implica rociar dsRNA como un pesticida convencional. Esto permitiría una adaptación más rápida a la resistencia. Tales enfoques requerirían fuentes de bajo costo de dsRNA que no existen actualmente. [3]
Cribado a escala del genoma
La investigación de ARNi a escala genómica se basa en la tecnología de cribado de alto rendimiento (HTS). La tecnología RNAi HTS permite la detección de pérdida de función en todo el genoma y se utiliza ampliamente en la identificación de genes asociados con fenotipos específicos. Esta tecnología ha sido aclamada como una posible segunda ola genómica, después de la primera ola genómica de microarrays de expresión génica y plataformas de descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido . [178] Una de las principales ventajas de la detección de ARNi a escala genómica es su capacidad para interrogar simultáneamente a miles de genes. Con la capacidad de generar una gran cantidad de datos por experimento, la detección de ARNi a escala del genoma ha llevado a una explosión de las tasas de generación de datos. La explotación de conjuntos de datos tan grandes es un desafío fundamental, que requiere métodos estadísticos / bioinformáticos adecuados. El proceso básico de detección de ARNi basado en células incluye la elección de una biblioteca de ARNi, tipos de células robustas y estables, transfección con agentes de ARNi, tratamiento / incubación, detección de señales, análisis e identificación de genes importantes o dianas terapéuticas. [179]
Historia
El proceso de RNAi se denominó "cosupresión" y "sofocación" cuando se observó antes del conocimiento de un mecanismo relacionado con el RNA. El descubrimiento de RNAi fue precedido primero por observaciones de inhibición transcripcional por RNA antisentido expresado en plantas transgénicas , [181] y más directamente por informes de resultados inesperados en experimentos realizados por científicos de plantas en los Estados Unidos y los Países Bajos a principios de la década de 1990. [182] En un intento por alterar los colores de las flores en las petunias , los investigadores introdujeron copias adicionales de un gen que codifica la calcona sintasa , una enzima clave para la pigmentación de las flores en plantas de petunia de color normalmente rosa o violeta. Se esperaba que el gen sobreexpresado produjera flores más oscuras, pero en cambio provocó que algunas flores tuvieran un pigmento púrpura menos visible, a veces en patrones abigarrados, lo que indica que la actividad de la chalcona sintasa había disminuido sustancialmente o se había suprimido de una manera específica del contexto. Esto se explicaría más tarde como el resultado de que el transgén se inserta junto a los promotores en la dirección opuesta en varias posiciones a lo largo de los genomas de algunos transformantes, lo que conduce a la expresión de transcritos antisentido y al silenciamiento de genes cuando estos promotores están activos. Otra observación temprana de ARNi provino de un estudio del hongo Neurospora crassa , [183] aunque no se reconoció de inmediato como relacionado. Una mayor investigación del fenómeno en plantas indicó que la regulación a la baja se debió a la inhibición postranscripcional de la expresión génica a través de una mayor tasa de degradación del ARNm. [184] Este fenómeno se denominó cosupresión de la expresión génica , pero el mecanismo molecular seguía siendo desconocido. [185]
No mucho después, los virólogos de plantas que trabajaban para mejorar la resistencia de las plantas a las enfermedades virales observaron un fenómeno similar inesperado. Si bien se sabía que las plantas que expresaban proteínas específicas de virus mostraban una mayor tolerancia o resistencia a la infección viral, no se esperaba que las plantas que llevaban solo regiones cortas no codificantes de secuencias de ARN viral mostraran niveles similares de protección. Los investigadores creían que el ARN viral producido por transgenes también podría inhibir la replicación viral. [186] El experimento inverso, en el que se introdujeron secuencias cortas de genes de plantas en virus, mostró que el gen objetivo se suprimió en una planta infectada. [187] Este fenómeno se denominó "silenciamiento génico inducido por virus" (VIGS), y el conjunto de tales fenómenos se denominó colectivamente silenciamiento génico postranscripcional. [188]
Luego de estas observaciones iniciales en plantas, los laboratorios buscaron este fenómeno en otros organismos. [189] [190] El artículo de 1998 de Craig C. Mello y Andrew Fire en Nature informó sobre un potente efecto de silenciamiento de genes después de inyectar ARN bicatenario en C. elegans . [191] Al investigar la regulación de la producción de proteínas musculares, observaron que ni el ARNm ni las inyecciones de ARN antisentido tenían un efecto sobre la producción de proteínas, pero el ARN bicatenario silenciaba con éxito el gen objetivo. Como resultado de este trabajo, acuñaron el término ARNi . Este descubrimiento representó la primera identificación del agente causante del fenómeno. Fire y Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2006 . [5]
Ver también
- Interferencia de ARN dirigida por ADN
Referencias
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enlaces externos
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- Animación del proceso RNAi , de Nature
- NOVA scienceNOW explica RNAi - Un video de 15 minutos de la transmisión de Nova que se transmitió en PBS , el 26 de julio de 2005
- Silenciar genomas experimentos de interferencia de ARN (ARNi) y bioinformática en C. elegans para la educación. Del Dolan DNA Learning Center del Cold Spring Harbor Laboratory.
- Pantallas de ARNi en C. elegans en un formato líquido de 96 pocillos y su aplicación a la identificación sistemática de interacciones genéticas (un protocolo)
- 2 'Worm People' estadounidenses ganan el Nobel por su trabajo con ARN , de NY Times
- Enfoque web de Terapia Molecular : "El desarrollo de RNAi como estrategia terapéutica" , una colección de artículos gratuitos sobre RNAi como estrategia terapéutica.
- GenomeRNAi : una base de datos de fenotipos de experimentos de detección de interferencia de ARN en Drosophila melanogaster y Homo sapians
- Herramientas de RNAi Herramientas de interferencia de ARN prediseñadas y personalizadas