El sistema de modificación de restricción ( sistema RM ) se encuentra en bacterias y otros organismos procarióticos , y proporciona una defensa contra el ADN extraño , como el que tienen los bacteriófagos .
Las bacterias tienen enzimas de restricción , también llamadas endonucleasas de restricción , que escinden el ADN bicatenario en puntos específicos en fragmentos, que luego son degradados por otras endonucleasas. Esto evita la infección al destruir eficazmente el ADN extraño introducido por un agente infeccioso (como un bacteriófago ). Aproximadamente una cuarta parte de las bacterias conocidas poseen sistemas de RM y de esas aproximadamente la mitad tienen más de un tipo de sistema.
Como las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción son muy cortas, es casi seguro que la propia bacteria contenga algunas dentro de su genoma. Para evitar la destrucción de su propio ADN por las enzimas de restricción, se agregan grupos metilo . Estas modificaciones no deben interferir con el apareamiento de bases de ADN y, por lo tanto, generalmente solo se modifican unas pocas bases específicas en cada hebra.
Las endonucleasas rompen los enlaces fosfodiéster internos / no terminales. Lo hacen solo después de reconocer secuencias específicas en el ADN que generalmente tienen una longitud de 4-6 pares de bases y, a menudo, palindrómicas .
Historia
El sistema RM fue descubierto por primera vez por Salvatore Luria y Mary Human en 1952 y 1953. [1] [2] Descubrieron que los bacteriófagos que crecen dentro de una bacteria infectada podrían modificarse, de modo que tras su liberación y reinfección de una bacteria relacionada, la el crecimiento del bacteriófago está restringido (inhibido) (también descrito por Luria en su autobiografía en las páginas 45 y 99 en 1984). [3] En 1953, Jean Weigle y Giuseppe Bertani informaron ejemplos similares de modificación controlada por el huésped utilizando un sistema de bacteriófagos diferente. [4] Un trabajo posterior de Daisy Roulland-Dussoix y Werner Arber en 1962 [5] y muchos otros investigadores posteriores llevaron al entendimiento de que la restricción se debía al ataque y descomposición del ADN del bacteriófago modificado por enzimas específicas de las bacterias receptoras. El trabajo adicional de Hamilton O. Smith aisló Hin DII , la primera de la clase de enzimas que ahora se conocen como enzimas de restricción , mientras que Daniel Nathans demostró que puede usarse para mapeo de restricción . [6] Cuando estas enzimas se aislaron en el laboratorio, podrían usarse para la manipulación controlada del ADN, proporcionando así la base para el desarrollo de la ingeniería genética . Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1978 por su trabajo sobre modificación de restricciones.
Tipos
Hay cuatro categorías de sistemas de modificación de restricción: tipo I, tipo II, tipo III y tipo IV, todos con actividad de enzima de restricción y actividad de metilasa (excepto el tipo IV que no tiene actividad de metilasa). Fueron nombrados en el orden de descubrimiento, aunque el sistema de tipo II es el más común.
Los sistemas de tipo I son los más complejos y constan de tres polipéptidos: R (restricción), M (modificación) y S (especificidad). El complejo resultante puede escindir y metilar el ADN. Ambas reacciones requieren ATP y la escisión a menudo se produce a una distancia considerable del sitio de reconocimiento. La subunidad S determina la especificidad tanto de la restricción como de la metilación. La escisión se produce a distancias variables de la secuencia de reconocimiento, por lo que las bandas discretas no se visualizan fácilmente mediante electroforesis en gel .
Los sistemas de tipo II son los más simples y los más frecuentes. En lugar de trabajar como un complejo, la metiltransferasa y la endonucleasa están codificadas como dos proteínas separadas y actúan de forma independiente (no existe una proteína de especificidad). Ambas proteínas reconocen el mismo sitio de reconocimiento y, por lo tanto, compiten por la actividad. La metiltransferasa actúa como un monómero , metilando el dúplex una hebra a la vez. La endonucleasa actúa como un homodímero , lo que facilita la escisión de ambas cadenas. La escisión ocurre en una posición definida cerca o dentro de la secuencia de reconocimiento, produciendo así fragmentos discretos durante la electroforesis en gel. Por esta razón, los sistemas de Tipo II se utilizan en laboratorios para el análisis de ADN y la clonación de genes .
Los sistemas de tipo III tienen proteínas R (res) y M (mod) que forman un complejo de modificación y escisión. Sin embargo, la proteína M puede metilarse por sí sola. La metilación también solo ocurre en una hebra del ADN a diferencia de la mayoría de los otros mecanismos conocidos. El heterodímero formado por las proteínas R y M compite consigo mismo modificando y restringiendo la misma reacción. Esto resulta en una digestión incompleta. [7] [8]
Los sistemas de tipo IV no son verdaderos sistemas de RM porque solo contienen una enzima de restricción y no una metilasa. A diferencia de los otros tipos, las enzimas de restricción de tipo IV reconocen y cortan solo el ADN modificado. [9]
Función
Neisseria meningitidis tiene múltiples sistemas de endonucleasas de restricción de tipo II que se emplean en la transformación genética natural . La transformación genética natural es un proceso mediante el cual una célula bacteriana receptora puede tomar ADN de una célula bacteriana donante vecina e integrar este ADN en su genoma mediante recombinación. Aunque los primeros trabajos sobre sistemas de modificación por restricción se centraron en el beneficio para las bacterias de protegerse a sí mismas contra el ADN de bacteriófago invasor u otro ADN extraño, ahora se sabe que estos sistemas también se pueden utilizar para restringir el ADN introducido por transformación natural de otros miembros del mismo. o especies relacionadas.
En la bacteria patógena Neisseria meningitidis (meningococos), la competencia para la transformación es un proceso complejo y altamente evolucionado en el que múltiples proteínas en la superficie bacteriana, en las membranas y en el citoplasma interactúan con el ADN transformante entrante. Los sistemas de restricción-modificación son abundantes en el género Neisseria . N. meningitidis tiene múltiples sistemas de endonucleasas de restricción de tipo II. [10] Los sistemas de modificación de restricción en N. meningitidis varían en especificidad entre diferentes clados. [10] [11] Esta especificidad proporciona una barrera eficaz contra el intercambio de ADN entre clados. [10] Luria, en la página 99 de su autobiografía, [3] se refirió a tal comportamiento de restricción como "un caso extremo de hostilidad". La modificación-restricción parece ser uno de los principales impulsores del aislamiento sexual y la especiación en los meningococos. [12] Caugant y Maiden [13] sugirieron que los sistemas de restricción-modificación en meningococos pueden actuar para permitir el intercambio genético entre parientes muy cercanos mientras reducen (pero no previenen por completo) el intercambio genético entre meningococos pertenecientes a diferentes complejos clonales y especies relacionadas.
Los sistemas de RM también pueden actuar como elementos genéticos egoístas , forzando su mantenimiento en la célula a través de la muerte celular possegregacional. [14]
Algunos virus han desarrollado formas de subvertir el sistema de modificación de restricción, generalmente modificando su propio ADN, agregando grupos metilo o glicosilo , bloqueando así las enzimas de restricción. Otros virus, como los bacteriófagos T3 y T7, codifican proteínas que inhiben las enzimas de restricción.
Para contrarrestar estos virus, algunas bacterias han desarrollado sistemas de restricción que solo reconocen y escinden el ADN modificado, pero no actúan sobre el ADN sin modificar del huésped. Algunos procariotas han desarrollado múltiples tipos de sistemas de modificación de restricción.
Los sistemas de RM son más abundantes en especies promiscuas, en las que establecen rutas preferenciales de intercambio genético dentro y entre linajes con sistemas de RM afines. [15] Debido a que el repertorio y / o la especificidad de los sistemas de RM en los linajes bacterianos varían rápidamente, se espera que los flujos preferenciales de transferencia genética dentro de las especies cambien constantemente, produciendo redes de transferencia de genes dependientes del tiempo.
Aplicaciones
Biología Molecular
(a) Clonación: los sistemas RM pueden clonarse en plásmidos y seleccionarse debido a la resistencia proporcionada por la enzima de metilación. Una vez que el plásmido comienza a replicarse, la enzima de metilación se producirá y metilará el ADN del plásmido, protegiéndolo de una enzima de restricción específica.
(b) Polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción: las enzimas de restricción también se utilizan para analizar la composición del ADN con respecto a la presencia o ausencia de mutaciones que afectan la especificidad de la escisión de REasa. Cuando el tipo salvaje y los mutantes se analizan por digestión con diferentes REasas, los productos electroforéticos en gel varían en longitud, en gran parte porque los genes mutantes no se escinden en un patrón similar al de tipo silvestre para la presencia de mutaciones que hacen que las REasas no sean específicas de b a la secuencia mutante.
Terapia de genes
El sistema RM de bacterias se ha propuesto como modelo para diseñar vacunas y terapias genéticas o de genes antivirales humanos, ya que el sistema RM cumple una función defensiva innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos. [16] Se investiga sobre REases y ZFN que pueden escindir el ADN de varios virus humanos, incluidos HSV-2 , HPV de alto riesgo y VIH-1 , con el objetivo final de inducir mutagénesis diana y aberraciones de virus que infectan a humanos. [17] [18] [19] El genoma humano ya contiene remanentes de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para beneficio propio. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos mediante la exonucleasa de reparación primaria 1 (TREX1) y el complemento cruzado de reparación por escisión 1 (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión de extremos no homóloga ( NHEJ) que sigue al uso de ZFN sin una plantilla de reparación. [20] [21]
Un avance importante es la creación de enzimas de restricción artificiales creadas mediante la unión del dominio de escisión del ADN FokI con una serie de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas ahora nucleasas de dedos de zinc (ZFN). [22] Las ZFN son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped debido a su especificidad de secuencia mejorada. Las ZFN funcionan en pares, y su dimerización está mediada in situ a través del dominio FoKI. Cada matriz de dedos de zinc (ZFA) es capaz de reconocer 9-12 pares de bases, lo que equivale a 18-24 para el par. Un espaciador de 5-7 pb entre los sitios de escisión mejora aún más la especificidad de ZFN, lo que los convierte en una herramienta segura y más precisa que se puede aplicar en humanos. Se ha llevado a cabo un ensayo clínico reciente de fase I de ZFN para la abolición dirigida del correceptor CCR5 para el VIH-1. [23]
Su relación con elementos genéticos móviles (MGE)
Los sistemas de RM son actores importantes en la interacción coevolutiva entre los elementos genéticos móviles (MGE) y sus anfitriones. [24] Se ha informado que los genes que codifican los sistemas de RM se mueven entre genomas procarióticos dentro de MGE, como plásmidos, profagos, secuencias de inserción / transposones, elementos conjugativos integradores (ICE) e integrones. Sin embargo, recientemente se descubrió que hay relativamente pocos sistemas de RM en plásmidos, algunos en profagos y prácticamente ninguno en fagos. Por otro lado, todos estos MGE codifican un gran número de genes RM solitarios, en particular MTasas. [24] A la luz de esto, es probable que la movilidad de la RM sea menos dependiente de las MGE y más dependiente, por ejemplo, de la existencia de pequeños puntos calientes de integración genómica. También es posible que los sistemas de RM aprovechen con frecuencia otros mecanismos como la transformación natural, vesículas, nanotubos, agentes de transferencia de genes o transducción generalizada para moverse entre genomas.
Ver también
- Metilación
- Enzima restrictiva
Referencias
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