Microscópio electrónico escaneando


Un microscopio electrónico de barrido ( SEM ) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de una muestra escaneando la superficie con un haz de electrones enfocado . Los electrones interactúan con los átomos de la muestra, produciendo varias señales que contienen información sobre la topografía de la superficie y la composición de la muestra. El haz de electrones se escanea en un patrón de escaneo de trama y la posición del haz se combina con la intensidad de la señal detectada para producir una imagen. En el modo SEM más común, los electrones secundarios emitidos por átomos excitados por el haz de electrones se detectan utilizando un detector de electrones secundarios (Detector Everhart-Thornley ). El número de electrones secundarios que se pueden detectar y, por tanto, la intensidad de la señal, depende, entre otras cosas, de la topografía del espécimen. Algunos SEM pueden alcanzar resoluciones superiores a 1 nanómetro.

La imagen de los granos de polen tomada en un SEM muestra la profundidad de campo característica de las micrografías del SEM
El primer SEM de M. von Ardenne
Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de barrido (SEM)
SEM con cámara de muestra abierta
SEM de tipo analógico

Las muestras se observan en alto vacío en un SEM convencional, o en condiciones de bajo vacío o húmedo en un SEM de presión variable o ambiental, y en una amplia gama de temperaturas criogénicas o elevadas con instrumentos especializados. [1]

McMullan ha presentado un relato de la historia temprana de la microscopía electrónica de barrido. [2] [3] Aunque Max Knoll produjo una foto con un ancho de campo de objeto de 50 mm que muestra el contraste de canalización mediante el uso de un escáner de haz de electrones, [4] fue Manfred von Ardenne quien en 1937 inventó [5] un microscopio con alta resolución mediante el escaneo de un ráster muy pequeño con un haz de electrones demagnificado y finamente enfocado. Ardenne aplicó el barrido del haz de electrones en un intento de superar la resolución del microscopio electrónico de transmisión (TEM), así como de mitigar problemas sustanciales con la aberración cromática inherente a las imágenes reales en el TEM. Además, discutió los diversos modos de detección, posibilidades y teoría de SEM, [6] junto con la construcción del primer SEM de alta resolución . [7] El grupo de Zworykin informó sobre trabajos adicionales , [8] seguidos por los grupos de Cambridge en la década de 1950 y principios de la de 1960 [9] [10] [11] [12] encabezados por Charles Oatley , todo lo cual finalmente condujo al marketing del primer instrumento comercial de Cambridge Scientific Instrument Company como el "Stereoscan" en 1965, que fue entregado a DuPont .

Fuente de electrones emisor de Schottky
Volumen de interacción electrón-materia y tipos de señales generadas

Las señales utilizadas por un SEM para producir una imagen son el resultado de interacciones del haz de electrones con átomos a varias profundidades dentro de la muestra. Se producen varios tipos de señales, incluidos electrones secundarios (SE), electrones reflejados o retrodispersados (BSE), rayos X característicos y luz ( catodoluminiscencia ) (CL), corriente absorbida (corriente de muestra) y electrones transmitidos. Los detectores de electrones secundarios son equipos estándar en todos los SEM, pero es raro que una sola máquina tenga detectores para todas las demás señales posibles.

Los electrones secundarios tienen energías muy bajas del orden de 50 eV, lo que limita su camino libre medio en materia sólida. En consecuencia, los SE solo pueden escapar de los primeros nanómetros de la superficie de una muestra. La señal de los electrones secundarios tiende a estar muy localizada en el punto de impacto del haz de electrones primario, lo que permite recolectar imágenes de la superficie de la muestra con una resolución inferior a 1 nm . Los electrones retrodispersados ​​(BSE) son electrones de haz que se reflejan en la muestra por dispersión elástica . Dado que tienen una energía mucho más alta que los SE, emergen de ubicaciones más profundas dentro de la muestra y, en consecuencia, la resolución de las imágenes de BSE es menor que las imágenes de SE. Sin embargo, las EEB se utilizan a menudo en SEM analítico, junto con los espectros elaborados a partir de los rayos X característicos, porque la intensidad de la señal de la EEB está estrechamente relacionada con el número atómico (Z) de la muestra. Las imágenes de la EEB pueden proporcionar información sobre la distribución, pero no la identidad, de los diferentes elementos de la muestra. En las muestras compuestas predominantemente de elementos ligeros, tales como muestras biológicas, proyección de imagen de la imagen se EEB oro coloidal inmuno-etiquetas de 5 o 10 nm de diámetro, que de otra manera sería difícil o imposible de detectar en imágenes de electrones secundarios. [13] Los rayos X característicos se emiten cuando el haz de electrones elimina un electrón de la capa interna de la muestra, lo que hace que un electrón de mayor energía llene la capa y libere energía. La energía o longitud de onda de estos rayos X característicos se puede medir mediante espectroscopía de rayos X de dispersión de energía o espectroscopía de rayos X de dispersión de longitud de onda y se puede utilizar para identificar y medir la abundancia de elementos en la muestra y trazar su distribución.

Debido al haz de electrones muy estrecho, las micrografías SEM tienen una gran profundidad de campo que produce una apariencia tridimensional característica útil para comprender la estructura de la superficie de una muestra. [14] Esto se ejemplifica con la micrografía de polen que se muestra arriba. Es posible una amplia gama de aumentos, desde aproximadamente 10 veces (aproximadamente el equivalente a la de una lente de mano potente) hasta más de 500.000 veces, aproximadamente 250 veces el límite de aumento de los mejores microscopios ópticos .

Una araña recubierta de oro por pulverización catódica, preparada para su visualización con un SEM.
Micrografía de bajo voltaje (300 V) de distribución de gotas de adhesivo en un post-it . No se aplicó recubrimiento conductor: tal recubrimiento alteraría esta frágil muestra.

Las muestras SEM deben ser lo suficientemente pequeñas para caber en la platina de la muestra y pueden necesitar una preparación especial para aumentar su conductividad eléctrica y estabilizarlas, de modo que puedan soportar las condiciones de alto vacío y el haz de electrones de alta energía. Las muestras generalmente se montan rígidamente en un portamuestras o en un talón usando un adhesivo conductor. SEM se utiliza ampliamente para el análisis de defectos de obleas semiconductoras, y los fabricantes fabrican instrumentos que pueden examinar cualquier parte de una oblea semiconductora de 300 mm. Muchos instrumentos tienen cámaras que pueden inclinar un objeto de ese tamaño a 45 ° y proporcionar una rotación continua de 360 ​​°.

Las muestras no conductoras acumulan carga cuando son escaneadas por el haz de electrones, y especialmente en el modo de imagen de electrones secundarios, esto causa fallas de escaneo y otros artefactos de imagen. Para obtener imágenes convencionales en el SEM, las muestras deben ser eléctricamente conductoras , al menos en la superficie, y deben estar conectadas a tierra para evitar la acumulación de carga electrostática . Los objetos metálicos requieren poca preparación especial para SEM, excepto para la limpieza y el montaje conductivo en un talón de muestra. Los materiales no conductores se recubren normalmente con un revestimiento ultrafino de material conductor de la electricidad, depositado sobre la muestra mediante revestimiento por pulverización catódica a bajo vacío o mediante evaporación a alto vacío. Los materiales conductores en el uso actual de espécimen de revestimiento incluyen el oro , el oro / paladio de la aleación, platino , iridio , tungsteno , cromo , osmio , [13] y grafito . El recubrimiento con metales pesados ​​puede aumentar la relación señal / ruido para muestras de bajo número atómico (Z). La mejora surge porque se mejora la emisión de electrones secundarios para materiales con alto contenido de Z.

Una alternativa al recubrimiento para algunas muestras biológicas es aumentar la conductividad global del material mediante impregnación con osmio utilizando variantes del método de tinción OTO ( tetróxido de O-osmio , T- tiocarbohidrazida , O-osmio). [15] [16]

Se pueden obtener imágenes de muestras no conductoras sin recubrimiento utilizando un SEM ambiental (ESEM) o un modo de funcionamiento de SEM de bajo voltaje. En los instrumentos ESEM, la muestra se coloca en una cámara de presión relativamente alta y la columna óptica de electrones se bombea diferencialmente para mantener el vacío adecuadamente [ aclaración necesaria ] bajo en el cañón de electrones. La región de alta presión alrededor de la muestra en el ESEM neutraliza la carga y proporciona una amplificación de la señal del electrón secundario. [ cita requerida ] La SEM de bajo voltaje se realiza típicamente en un instrumento con pistolas de emisión de campo (FEG) que es capaz de producir un brillo de electrones primarios alto y un tamaño de punto pequeño incluso a potenciales de aceleración bajos. Para evitar la carga de muestras no conductoras, las condiciones de funcionamiento deben ajustarse de manera que la corriente del haz entrante sea igual a la suma de las corrientes de electrones secundarios y retrodispersados ​​salientes, una condición que se cumple con mayor frecuencia con voltajes de aceleración de 0,3 a 4 kV. [ cita requerida ]

La incrustación en una resina con un pulido adicional hasta obtener un acabado similar a un espejo se puede utilizar para muestras biológicas y de materiales cuando se obtienen imágenes en electrones retrodispersados ​​o cuando se realizan microanálisis cuantitativos de rayos X

Las principales técnicas de preparación no son necesarias en el SEM ambiental que se describe a continuación, pero algunas muestras biológicas pueden beneficiarse de la fijación.

Muestras biologicas

Para SEM, normalmente se requiere que una muestra esté completamente seca, ya que la cámara de la muestra está a alto vacío. Los materiales duros y secos como la madera, los huesos, las plumas, los insectos secos o las cáscaras (incluidas las cáscaras de huevo [17] ) se pueden examinar con poco tratamiento adicional, pero las células y tejidos vivos y los organismos enteros de cuerpo blando requieren fijación química para preservarlos. y estabilizar su estructura.

La fijación generalmente se realiza mediante incubación en una solución de un fijador químico tamponado , como glutaraldehído , a veces en combinación con formaldehído [18] [19] [20] y otros fijadores, [21] y opcionalmente seguido de postfijación con tetróxido de osmio. [18] Luego, el tejido fijado se deshidrata. Debido a que el secado al aire provoca colapso y encogimiento, esto se logra comúnmente reemplazando el agua en las celdas con solventes orgánicos como etanol o acetona , y reemplazando estos solventes a su vez con un fluido de transición como el dióxido de carbono líquido por secado de punto crítico . [22] El dióxido de carbono finalmente se elimina mientras se encuentra en un estado supercrítico, de modo que no haya una interfaz gas-líquido dentro de la muestra durante el secado.

La muestra seca generalmente se monta en un talón de muestra usando un adhesivo como resina epoxi o cinta adhesiva de doble cara conductora de electricidad, y se recubre por pulverización catódica con oro u aleación de oro / paladio antes de examinarla en el microscopio. Las muestras pueden seccionarse (con un micrótomo ) si se va a exponer información sobre la ultraestructura interna del organismo para la obtención de imágenes.

Si el SEM está equipado con una platina fría para microscopía criogénica, se puede utilizar la criofijación y realizar microscopía electrónica de barrido a baja temperatura en las muestras fijadas criogénicamente. [18] Las muestras crio-fijadas pueden crio-fracturarse al vacío en un aparato especial para revelar la estructura interna, recubrirse por pulverización catódica y transferirse a la crio-etapa SEM mientras aún están congeladas. [23] La microscopía electrónica de barrido a baja temperatura (LT-SEM) también es aplicable a la obtención de imágenes de materiales sensibles a la temperatura como el hielo [24] [25] y las grasas. [26]

La congelación-fractura, congelación-grabado o congelación y rotura es un método de preparación particularmente útil para examinar membranas lipídicas y sus proteínas incorporadas en una vista "frontal". El método de preparación revela las proteínas incrustadas en la bicapa lipídica.

Materiales

La obtención de imágenes de electrones de retrodispersión, el análisis cuantitativo de rayos X y el mapeo de rayos X de las muestras a menudo requieren esmerilar y pulir las superficies hasta obtener una superficie ultra lisa. Las muestras que se someten a análisis WDS o EDS a menudo están recubiertas de carbón. En general, los metales no se recubren antes de la formación de imágenes en el SEM porque son conductores y proporcionan su propio camino a tierra.

La fractografía es el estudio de superficies fracturadas que se puede realizar en un microscopio óptico o, comúnmente, en un SEM. La superficie fracturada se corta a un tamaño adecuado, se limpia de cualquier residuo orgánico y se monta en un portamuestras para su visualización en el SEM.

Los circuitos integrados se pueden cortar con un haz de iones enfocado (FIB) u otro instrumento de fresado de haz de iones para verlos en el SEM. En el primer caso, el SEM puede incorporarse al FIB, lo que permite obtener imágenes de alta resolución del resultado del proceso.

Los metales, las muestras geológicas y los circuitos integrados también pueden pulirse químicamente para su visualización en el SEM.

Se requieren técnicas especiales de recubrimiento de alta resolución para obtener imágenes de gran aumento de películas delgadas inorgánicas.

Esquema de un SEM

En un SEM típico, un haz de electrones se emite termoiónicamente desde un cañón de electrones equipado con un cátodo de filamento de tungsteno . El tungsteno se usa normalmente en pistolas de electrones termoiónicos porque tiene el punto de fusión más alto y la presión de vapor más baja de todos los metales, lo que permite que se caliente eléctricamente para la emisión de electrones y debido a su bajo costo. Otros tipos de emisores de electrones incluyen hexaboruro de lantano ( LaB
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) cátodos, que se pueden usar en un SEM de filamento de tungsteno estándar si se actualiza el sistema de vacío o pistolas de emisión de campo (FEG), que pueden ser del tipo de cátodo frío con emisores de cristal único de tungsteno o del tipo Schottky asistido térmicamente , que utilizan emisores de monocristales de tungsteno recubiertos de óxido de circonio .

El haz de electrones, que normalmente tiene una energía que varía de 0,2 keV a 40 keV, se enfoca mediante una o dos lentes de condensador a un punto de aproximadamente 0,4 nm a 5 nm de diámetro. El haz pasa a través de pares de la exploración de bobinas o pares de placas de desviación en la columna de electrones, típicamente en la lente final, que desvían el haz en la x y y ejes de manera que explora en una trama de la manera sobre un área rectangular de la superficie de la muestra .

Mecanismos de emisión de electrones secundarios, electrones retrodispersados ​​y rayos X característicos de los átomos de la muestra.

Cuando el haz de electrones primario interactúa con la muestra, los electrones pierden energía por dispersión aleatoria repetida y absorción dentro de un volumen en forma de lágrima de la muestra conocido como volumen de interacción , que se extiende desde menos de 100 nm hasta aproximadamente 5 µm en la superficie. El tamaño del volumen de interacción depende de la energía de aterrizaje del electrón, el número atómico de la muestra y la densidad de la muestra. El intercambio de energía entre el haz de electrones y la muestra da como resultado la reflexión de electrones de alta energía por dispersión elástica, la emisión de electrones secundarios por dispersión inelástica y la emisión de radiación electromagnética , cada una de las cuales puede ser detectada por detectores especializados. La corriente del haz absorbida por la muestra también se puede detectar y utilizar para crear imágenes de la distribución de la corriente de la muestra. Se utilizan amplificadores electrónicos de varios tipos para amplificar las señales, que se muestran como variaciones de brillo en un monitor de computadora (o, para modelos antiguos, en un tubo de rayos catódicos ). Cada píxel de la memoria de video de la computadora está sincronizado con la posición del rayo en la muestra en el microscopio, y la imagen resultante es, por lo tanto, un mapa de distribución de la intensidad de la señal que se emite desde el área escaneada de la muestra. Los microscopios más antiguos capturaban imágenes en película, pero la mayoría de los instrumentos modernos recopilan imágenes digitales .

Serie de aumentos SEM de baja temperatura para un cristal de nieve . Los cristales se capturan, almacenan y se recubren con platino a temperaturas criogénicas para la obtención de imágenes.

Aumento

La ampliación en un SEM se puede controlar en un rango de aproximadamente 6 órdenes de magnitud de aproximadamente 10 a 3.000.000 de veces. [27] A diferencia de los microscopios ópticos y electrónicos de transmisión, la ampliación de la imagen en un SEM no es una función de la potencia de la lente del objetivo . Los SEM pueden tener lentes de condensador y objetivo, pero su función es enfocar el haz a un punto y no tomar imágenes de la muestra. Siempre que el cañón de electrones pueda generar un haz con un diámetro suficientemente pequeño, un SEM podría en principio funcionar completamente sin lentes de condensador o objetivo, aunque podría no ser muy versátil o lograr una resolución muy alta. En un SEM, como en la microscopía de sonda de barrido , el aumento resulta de la relación entre las dimensiones de la trama en la muestra y la trama en el dispositivo de visualización. Suponiendo que la pantalla de visualización tiene un tamaño fijo, se obtiene un aumento mayor al reducir el tamaño de la trama en la muestra, y viceversa. Por tanto, el aumento se controla mediante la corriente suministrada a las bobinas de exploración x, y, o el voltaje suministrado a las placas deflectoras x, y, y no mediante la potencia de la lente del objetivo.

El modo de obtención de imágenes más común recoge electrones secundarios de baja energía (<50 eV) que se expulsan de las bandas de conducción o de valencia de los átomos de la muestra mediante interacciones de dispersión inelástica con los electrones del haz. Debido a su baja energía, estos electrones se originan a unos pocos nanómetros por debajo de la superficie de la muestra. [14] Los electrones son detectados por un detector Everhart-Thornley , [28] que es un tipo de sistema colector- centelleador - fotomultiplicador . Los electrones secundarios se recogen primero atrayéndolos hacia una red polarizada eléctricamente a aproximadamente +400 V, y luego se aceleran aún más hacia un fósforo o centelleador polarizado positivamente a aproximadamente +2.000 V. Los electrones secundarios acelerados ahora son lo suficientemente energéticos como para hacer que el centelleador emiten destellos de luz (catodoluminiscencia), que se conducen a un fotomultiplicador fuera de la columna SEM a través de un tubo de luz y una ventana en la pared de la cámara de muestras. La señal eléctrica amplificada emitida por el fotomultiplicador se muestra como una distribución de intensidad bidimensional que se puede ver y fotografiar en una pantalla de video analógica , o someter a conversión de analógico a digital y mostrarse y guardarse como una imagen digital . Este proceso se basa en un rayo primario escaneado por trama. El brillo de la señal depende del número de electrones secundarios que llegan al detector . Si el rayo entra en la muestra perpendicular a la superficie, entonces la región activada es uniforme alrededor del eje del rayo y un cierto número de electrones "escapan" del interior de la muestra. A medida que aumenta el ángulo de incidencia, el volumen de interacción aumenta y la distancia de "escape" de un lado del haz disminuye, lo que resulta en la emisión de más electrones secundarios de la muestra. Por lo tanto, las superficies y los bordes empinados tienden a ser más brillantes que las superficies planas, lo que da como resultado imágenes con una apariencia tridimensional bien definida. Es posible utilizar la señal de los electrones secundarios con una resolución de imagen inferior a 0,5 nm.

Comparación de técnicas SEM:
Arriba: análisis de electrones retrodispersados ​​- composición
Abajo: análisis de electrones secundarios - topografía

Los electrones retrodispersados ​​(BSE) consisten en electrones de alta energía que se originan en el haz de electrones, que son reflejados o retrodispersados ​​fuera del volumen de interacción de la muestra mediante interacciones de dispersión elástica con los átomos de la muestra. Dado que los elementos pesados ​​(número atómico alto) retrodispersan los electrones con más fuerza que los elementos ligeros (número atómico bajo) y, por lo tanto, aparecen más brillantes en la imagen, las EEB se utilizan para detectar el contraste entre áreas con diferentes composiciones químicas. [14] El detector Everhart-Thornley, que normalmente se coloca a un lado de la muestra, es ineficaz para la detección de electrones retrodispersados ​​porque pocos de esos electrones se emiten en el ángulo sólido subtendido por el detector y porque la rejilla de detección con polarización positiva tiene poca capacidad para atraer la EEB de mayor energía. Los detectores de electrones retrodispersados ​​dedicados se colocan encima de la muestra en una disposición tipo "rosquilla", concéntrica con el haz de electrones, maximizando el ángulo sólido de recolección. Los detectores de EEB suelen ser de centelleo o de semiconductores. Cuando todas las partes del detector se utilizan para recolectar electrones simétricamente alrededor del haz, se produce un contraste de número atómico. Sin embargo, se produce un fuerte contraste topográfico al recolectar electrones retrodispersados ​​de un lado por encima de la muestra utilizando un detector BSE direccional asimétrico; el contraste resultante aparece como iluminación de la topografía desde ese lado. Los detectores de semiconductores se pueden fabricar en segmentos radiales que se pueden activar o desactivar para controlar el tipo de contraste producido y su direccionalidad.

Los electrones retrodispersados ​​también se pueden utilizar para formar una imagen de difracción por retrodispersión de electrones ( EBSD ) que se puede utilizar para determinar la estructura cristalográfica de la muestra.

La naturaleza de la sonda del SEM, los electrones energéticos, lo hace especialmente adecuado para examinar las propiedades ópticas y electrónicas de los materiales semiconductores. Los electrones de alta energía del haz SEM inyectarán portadores de carga en el semiconductor. Por lo tanto, los electrones del haz pierden energía al promover electrones de la banda de valencia a la banda de conducción , dejando huecos .

En un material de banda prohibida directa , la recombinación de estos pares de electrones y huecos dará como resultado una catodoluminiscencia; si la muestra contiene un campo eléctrico interno, como el que está presente en una unión pn , la inyección del haz de SEM de los portadores hará que fluya la corriente inducida por haz de electrones (EBIC). La catodoluminiscencia y el EBIC se denominan técnicas de "inyección de haz" y son sondas muy potentes del comportamiento optoelectrónico de los semiconductores, en particular para estudiar características y defectos a nanoescala.

Superposición de catodoluminiscencia de color en la imagen SEM de un policristal de InGaN . Los canales azul y verde representan colores reales, el canal rojo corresponde a la emisión de UV.

La catodoluminiscencia , la emisión de luz cuando los átomos excitados por electrones de alta energía regresan a su estado fundamental, es análoga a la fluorescencia inducida por UV , y algunos materiales como el sulfuro de zinc y algunos tintes fluorescentes exhiben ambos fenómenos. Durante las últimas décadas, la catodoluminiscencia se experimentó más comúnmente como la emisión de luz de la superficie interna del tubo de rayos catódicos en televisores y monitores CRT de computadora. En el SEM, los detectores CL recogen toda la luz emitida por la muestra o pueden analizar las longitudes de onda emitidas por la muestra y mostrar un espectro de emisión o una imagen de la distribución de la catodoluminiscencia emitida por la muestra en color real.

Los rayos X característicos que se producen por la interacción de electrones con la muestra también pueden detectarse en un SEM equipado para espectroscopía de rayos X de dispersión de energía o espectroscopía de rayos X de dispersión de longitud de onda . El análisis de las señales de rayos X se puede utilizar para mapear la distribución y estimar la abundancia de elementos en la muestra.

"> Reproducir medios
Un video que ilustra un rango de aumento práctico típico de un microscopio electrónico de barrido diseñado para muestras biológicas. El video comienza en 25 ×, aproximadamente 6 mm en todo el campo de visión, y se amplía a 12000 ×, aproximadamente 12  μm en todo el campo de visión. Los objetos esféricos son perlas de vidrio con un diámetro de 10 μm, similar en diámetro a un glóbulo rojo .

SEM no es una cámara y el detector no está formando imágenes continuamente como una matriz o película CCD . A diferencia de un sistema óptico, la resolución no está limitada por el límite de difracción , la finura de las lentes o espejos o la resolución de la matriz de detectores. La óptica de enfoque puede ser grande y tosca, y el detector SE tiene el tamaño de un puño y simplemente detecta la corriente. En cambio, la resolución espacial del SEM depende del tamaño del punto de electrones, que a su vez depende tanto de la longitud de onda de los electrones como del sistema electrónico-óptico que produce el haz de barrido. La resolución también está limitada por el tamaño del volumen de interacción, el volumen de material de la muestra que interactúa con el haz de electrones. El tamaño del punto y el volumen de interacción son grandes en comparación con las distancias entre átomos, por lo que la resolución del SEM no es lo suficientemente alta para obtener imágenes de átomos individuales, como es posible con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Sin embargo, el SEM tiene ventajas compensatorias, incluida la capacidad de obtener imágenes de un área comparativamente grande de la muestra; la capacidad de obtener imágenes de materiales a granel (no solo películas delgadas o láminas); y la variedad de modos analíticos disponibles para medir la composición y propiedades de la muestra. Dependiendo del instrumento, la resolución puede caer entre menos de 1 nm y 20 nm. A partir de 2009, el SEM convencional (≤30 kV) de mayor resolución del mundo puede alcanzar una resolución puntual de 0,4 nm utilizando un detector de electrones secundarios. [29]

La SEM convencional requiere que se obtengan imágenes de las muestras al vacío , porque una atmósfera de gas se propaga rápidamente y atenúa los haces de electrones. Como consecuencia, las muestras que producen una cantidad significativa de vapor , por ejemplo, muestras biológicas húmedas o rocas petrolíferas, deben secarse o congelarse criogénicamente. Los procesos que involucran transiciones de fase , como el secado de adhesivos o la fusión de aleaciones , transporte de líquidos, reacciones químicas y sistemas sólido-aire-gas, en general, no se pueden observar con SEM de alto vacío convencional. En SEM ambiental (ESEM), la cámara se evacua de aire, pero el vapor de agua se retiene cerca de su presión de saturación y la presión residual permanece relativamente alta. Esto permite el análisis de muestras que contienen agua u otras sustancias volátiles. Con ESEM, las observaciones de insectos vivos han sido posibles. [30]

El primer desarrollo comercial del ESEM a fines de la década de 1980 [31] [32] permitió que las muestras se observaran en ambientes gaseosos de baja presión (por ejemplo, 1-50 Torr o 0.1-6.7 kPa) y alta humedad relativa (hasta 100%) . Esto fue posible gracias al desarrollo de un detector de electrones secundarios [33] [34] capaz de operar en presencia de vapor de agua y mediante el uso de aberturas limitadoras de presión con bombeo diferencial en la trayectoria del haz de electrones para separar el haz de electrones. región de vacío (alrededor de la pistola y las lentes) de la cámara de muestra. Los primeros ESEM comerciales fueron producidos por ElectroScan Corporation en EE. UU. En 1988. Philips (que más tarde vendió su división de electrónica-óptica a FEI Company) se hizo cargo de ElectroScan en 1996. [35]

ESEM es especialmente útil para materiales biológicos y no metálicos porque el recubrimiento con carbono u oro es innecesario. Los plásticos y elastómeros no recubiertos se pueden examinar de forma rutinaria, al igual que las muestras biológicas no recubiertas. Esto es útil porque el recubrimiento puede ser difícil de revertir, puede ocultar pequeñas características en la superficie de la muestra y puede reducir el valor de los resultados obtenidos. El análisis de rayos X es difícil con un recubrimiento de un metal pesado, por lo que los recubrimientos de carbono se utilizan de forma rutinaria en los SEM convencionales, pero el ESEM permite realizar microanálisis de rayos X en muestras no conductoras sin recubrimiento; sin embargo, se introducen algunos artefactos específicos para ESEM en el análisis de rayos X. ESEM puede ser el preferido para microscopía electrónica de muestras únicas de acciones penales o civiles, donde el análisis forense puede necesitar ser repetido por varios expertos diferentes. Es posible estudiar muestras en líquido con ESEM o con otros métodos de microscopía electrónica en fase líquida . [36]

El SEM también se puede utilizar en modo de transmisión simplemente incorporando un detector apropiado debajo de una sección de muestra delgada. [37] Los detectores están disponibles para campo claro, campo oscuro, así como detectores segmentados para campo oscuro anular de campo medio a alto ángulo . A pesar de la diferencia en la instrumentación, esta técnica todavía se conoce comúnmente como microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) .

Los microscopios electrónicos no producen imágenes en color de forma natural, ya que un SEM produce un valor único por píxel; este valor corresponde al número de electrones recibidos por el detector durante un pequeño período de tiempo de exploración cuando el haz se dirige a la posición de píxel (x, y).

Este único número suele estar representado, para cada píxel, por un nivel de gris, formando una imagen monocromática. [38] Sin embargo, se han utilizado varias formas para obtener imágenes de microscopía electrónica en color. [39]

Falso color usando un solo detector

  • En imágenes de composición de superficies planas (típicamente BSE):

La forma más fácil de obtener color es asociar a este único número un color arbitrario, utilizando una tabla de búsqueda de colores (es decir, cada nivel de gris se reemplaza por un color elegido). Este método se conoce como color falso . En una imagen de EEB, se puede realizar un color falso para distinguir mejor las diversas fases de la muestra. [40]

  • En imágenes de superficie texturizada:

Como alternativa a la simple sustitución de cada nivel de gris por un color, una muestra observada por un haz oblicuo permite a los investigadores crear una imagen de topografía aproximada (consulte la sección adicional "Representación fotométrica 3D de una sola imagen SEM" ). Luego, dicha topografía se puede procesar mediante algoritmos de renderizado 3D para obtener un renderizado más natural de la textura de la superficie.

  • Superficie de un cálculo renal

  • Lo mismo después del reprocesamiento del color de la topografía estimada.

  • Imagen SEM de un discoaster alterado diagenéticamente

  • La misma imagen después de una coloración similar.

Coloración de imágenes SEM

Muy a menudo, las imágenes SEM publicadas se colorean artificialmente. [40] Esto puede hacerse por efecto estético, para aclarar la estructura o para agregar una apariencia realista a la muestra y generalmente no agrega información sobre la muestra. [41]

La coloración se puede realizar manualmente con un software de edición de fotografías o semiautomáticamente con un software dedicado utilizando la detección de características o la segmentación orientada a objetos. [42]

  • Imagen SEM del polen de Cobaea scandens

  • Lo mismo después de la coloración semiautomática. Los colores arbitrarios ayudan a identificar los diversos elementos de la estructura.

  • Imagen SEM coloreada de polen y estambres de Tradescantia

  • Imagen SEM coloreada de intercrecimiento de cristales de arsenopirita y oro nativo

Color construido usando múltiples detectores de electrones

En algunas configuraciones, se recopila más información por píxel, a menudo mediante el uso de varios detectores. [43]

Como ejemplo común, los detectores de electrones secundarios y de electrones retrodispersados ​​se superponen y se asigna un color a cada una de las imágenes capturadas por cada detector, [44] [45] con un resultado final de una imagen de color combinada donde los colores están relacionados con la densidad de los componentes. Este método se conoce como SEM de color dependiente de la densidad (DDC-SEM). Las micrografías producidas por DDC-SEM retienen información topográfica, que es mejor capturada por el detector de electrones secundarios y la combinan con la información sobre la densidad, obtenida por el detector de electrones retrodispersados. [46] [47]

  • DDC-SEM de partícula calcificada en tejido cardíaco - Señal 1: SE

  • Señal 2: EEB

  • Imagen coloreada obtenida de las dos anteriores. Micrografía electrónica de barrido de color dependiente de la densidad SEM (DDC-SEM) de calcificación cardiovascular, que muestra en naranja una partícula esférica de fosfato de calcio (material más denso) y, en verde, la matriz extracelular (material menos denso)

  • Mismo trabajo con una visión más amplia, parte de un estudio sobre la calcificación del tejido cardiovascular humano

Señales analíticas basadas en fotones generados

La medición de la energía de los fotones emitidos por la muestra es un método común para obtener capacidades analíticas. Algunos ejemplos son los detectores de espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDS) utilizados en el análisis elemental y los sistemas de microscopio de catodoluminiscencia (CL) que analizan la intensidad y el espectro de luminiscencia inducida por electrones en (por ejemplo) muestras geológicas. En los sistemas SEM que utilizan estos detectores, es común codificar por colores estas señales adicionales y superponerlas en una imagen de un solo color, de modo que las diferencias en la distribución de los diversos componentes de la muestra se puedan ver claramente y comparar. Opcionalmente, la imagen de electrones secundarios estándar se puede fusionar con uno o más canales de composición, de modo que se pueda comparar la estructura y composición de la muestra. Estas imágenes se pueden realizar manteniendo la integridad total de los datos de la señal original, que no se modifica de ninguna manera.

Los SEM no proporcionan naturalmente imágenes en 3D contrarias a los SPM . Sin embargo, los datos 3D se pueden obtener utilizando un SEM con diferentes métodos como se indica a continuación.

Reconstrucción 3D SEM a partir de un par estéreo

  • La fotogrametría es el método metrológicamente más preciso para llevar la tercera dimensión a las imágenes SEM. [40] A diferencia de los métodos fotométricos (siguiente párrafo), la fotogrametría calcula las alturas absolutas mediante métodos de triangulación . Los inconvenientes son que funciona solo si hay una textura mínima, y ​​requiere que se adquieran dos imágenes desde dos ángulos diferentes, lo que implica el uso de un escenario tilt. (La fotogrametría es una operación de software que calcula el desplazamiento (o "disparidad") para cada píxel, entre la imagen de la izquierda y la imagen de la derecha del mismo par. Tal disparidad refleja la altura local).
  • Un par estéreo SEM de microfósiles de menos de 1 mm de tamaño ( Ostracoda ) producido al inclinarse a lo largo del eje longitudinal.

  • A partir de este par de imágenes SEM, la tercera dimensión ha sido reconstruida por fotogrametría (usando el software MountainsSEM , ver imagen siguiente); luego, se han realizado una serie de representaciones en 3D con diferentes ángulos y se han ensamblado en un archivo GIF para producir esta animación.

  • Reconstrucción de la superficie en 3D de una muestra de calibración de rugosidad (Ra = 3 µm) (como se usa para calibrar perfilómetros), a partir de 2 imágenes de microscopio electrónico de barrido inclinadas 15 ° (arriba a la izquierda). El cálculo del modelo 3D (abajo a la derecha) tarda aproximadamente 1,5 segundos [48] y el error en el valor de rugosidad Ra calculado es inferior al 0,5%.

Reconstrucción fotométrica 3D SEM a partir de un detector de cuatro cuadrantes por "forma a partir del sombreado"

Este método normalmente utiliza un detector de EEB de cuatro cuadrantes (alternativamente para un fabricante, un detector de 3 segmentos). El microscopio produce cuatro imágenes de la misma muestra al mismo tiempo, por lo que no es necesario inclinar la muestra. El método proporciona dimensiones tridimensionales metrológicas en la medida en que la pendiente de la muestra sigue siendo razonable. [40] La mayoría de los fabricantes de SEM ahora (2018) ofrecen un detector BSE de cuatro cuadrantes integrado u opcional, junto con software patentado para calcular una imagen 3D en tiempo real. [49]

Otros enfoques utilizan métodos más sofisticados (ya veces intensivos en GPU), como el algoritmo de estimación óptima , y ofrecen resultados mucho mejores [50] a costa de altas demandas de potencia informática.

En todos los casos, este enfoque funciona mediante la integración de la pendiente, por lo que se ignoran las pendientes verticales y los voladizos; por ejemplo, si una esfera entera se encuentra en un plano, poco más que el hemisferio superior se ve emergiendo por encima del plano, lo que da como resultado una altitud incorrecta del vértice de la esfera. La prominencia de este efecto depende del ángulo de los detectores de EEB con respecto a la muestra, pero estos detectores suelen estar situados alrededor (y cerca) del haz de electrones, por lo que este efecto es muy común.

Representación fotométrica 3D de una sola imagen SEM

Este método requiere una imagen SEM obtenida con iluminación oblicua de ángulo bajo. El nivel de gris se interpreta entonces como la pendiente y la pendiente se integra para restaurar la topografía del espécimen. Este método es interesante para la mejora visual y la detección de la forma y posición de los objetos; sin embargo, las alturas verticales generalmente no se pueden calibrar, a diferencia de otros métodos como la fotogrametría. [40]

  • Imagen SEM de la superficie del ojo compuesto de una mosca doméstica con un aumento de 450 ×.

  • Detalle de la imagen anterior.

  • Reconstrucción SEM 3D de la anterior utilizando formas de algoritmos de sombreado .

  • Igual que el anterior, pero con iluminación homogeneizada antes de aplicar la forma de los algoritmos de sombreado

Otros tipos de reconstrucción 3D SEM

  • Reconstrucción inversa utilizando modelos interactivos de material electrónico [51] [52]
  • Reconstrucción de múltiples resoluciones utilizando un solo archivo 2D: las imágenes en 3D de alta calidad pueden ser una solución definitiva para revelar las complejidades de cualquier medio poroso, pero adquirirlos es costoso y requiere mucho tiempo. Las imágenes SEM 2D de alta calidad, por otro lado, están ampliamente disponibles. Recientemente, se presenta un nuevo método de reconstrucción de tres pasos, multiescala y multiresolución que utiliza directamente imágenes 2D para desarrollar modelos 3D. Este método, basado en una entropía de Shannon y simulación condicional, se puede utilizar para la mayoría de los materiales estacionarios disponibles y puede construir varios modelos 3D estocásticos utilizando solo unas pocas secciones delgadas. [53] [54] [55]
  • La SEM de abrasión iónica (IA-SEM) es un método de obtención de imágenes en 3D a nanoescala que utiliza un haz de galio enfocado para desgastar repetidamente la superficie de la muestra 20 nanómetros a la vez. Luego, cada superficie expuesta se escanea para compilar una imagen en 3D. [56] [57]

Aplicaciones de 3D SEM

Una posible aplicación es medir la rugosidad de los cristales de hielo. Este método puede combinar SEM ambiental de presión variable y las capacidades 3D del SEM para medir la rugosidad en las facetas individuales de los cristales de hielo, convertirlo en un modelo de computadora y ejecutar análisis estadísticos adicionales en el modelo. [58] Otras mediciones incluyen dimensión fractal, examen de la superficie de fractura de metales, caracterización de materiales, medición de corrosión y mediciones dimensionales a nanoescala (altura de paso, volumen, ángulo, planitud, relación de apoyo, coplanariedad, etc.). [ cita requerida ]

Los siguientes son ejemplos de imágenes tomadas con un SEM.

  • Imagen SEM coloreada del nematodo del quiste de la soja y el huevo. La coloración artificial hace que la imagen sea más fácil para que los no especialistas vean y comprendan las estructuras y superficies reveladas en las micrografías.

  • Ojo compuesto de krill antártico Euphausia superba . Los ojos de artrópodo son un tema común en las micrografías SEM debido a la profundidad de enfoque que puede capturar una imagen SEM. Imagen coloreada.

  • Ommatidia del ojo de krill antártico , un aumento mayor del ojo de krill. Los SEM cubren un rango desde microscopía óptica hasta los aumentos disponibles con un TEM . Imagen coloreada.

  • Imagen SEM de sangre humana en circulación normal . Esta es una micrografía antigua y ruidosa de un tema común para las micrografías SEM: glóbulos rojos.

  • Imagen SEM de un hederelloide del Devónico de Michigan (el diámetro del tubo más grande es de 0,75 mm). El SEM se utiliza ampliamente para capturar imágenes detalladas de micro y macro fósiles.

  • Imagen de electrones retrodispersados ​​(EEB) de una región rica en antimonio en un fragmento de vidrio antiguo. Los museos usan SEM para estudiar artefactos valiosos de una manera no destructiva.

  • Imagen SEM de la capa de corrosión en la superficie de un fragmento de vidrio antiguo; nótese la estructura laminar de la capa de corrosión.

  • Imagen SEM de una capa fotorresistente utilizada en la fabricación de semiconductores tomada en un SEM de emisión de campo . Estos SEM son importantes en la industria de los semiconductores por sus capacidades de alta resolución.

  • Imagen SEM de la superficie de un cálculo renal que muestra cristales tetragonales de Weddellita (oxalato de calcio dihidrato) que emergen de la parte central amorfa del cálculo. La longitud horizontal de la imagen representa 0,5 mm del original figurado.

  • Dos imágenes de cristal de nieve de la misma profundidad , vistas a través de un microscopio óptico (izquierda) y como una imagen SEM (derecha). Observe cómo la imagen SEM permite una percepción clara de los detalles de la estructura fina que son difíciles de distinguir por completo en la imagen del microscopio óptico.

  • Células epidérmicas de la superficie interna de un copo de cebolla . Debajo de las paredes celulares en forma de shagreen se pueden ver núcleos y pequeños orgánulos flotando en el citoplasma. Esta imagen de EEB de una muestra teñida con lantanoides se tomó sin fijación previa, ni deshidratación ni pulverización catódica.

  • Imagen SEM de estomas en la superficie inferior de una hoja.

  • Aplicaciones para microscopía electrónica
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  • Microscopía
  • Teeny Ted de Turnip Town (el libro más pequeño del mundo requiere un microscopio electrónico de barrido para leerlo).
  • Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

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General
  • HowStuffWorks - Cómo funcionan los microscopios electrónicos de barrido
  • Notas sobre el SEM Notas que cubren todos los aspectos del SEM
  • Conceptos básicos de microscopía electrónica de barrido un tutorial animado sobre cómo funciona SEM
  • Aprenda a usar un SEM : un entorno de aprendizaje en línea para personas que desean usar un SEM. Proporcionado por Microscopy Australia
  • Virtual SEM - bengala  - una simulación interactiva de un microscopio electrónico de barrido (SEM)
  • Preparando una muestra para el SEM preparando un tema no conductor para el SEM ( QuickTime -movie)
  • formación de imágenes de múltiples canales de color SEM  - y con BSE
  • Ejemplos de imágenes DDC-SEM
  • Vídeo sobre el microscopio electrónico de barrido , Universidad de Ciencias Aplicadas de Karlsruhe
  • animaciones y explicaciones sobre varios tipos de microscopios, incluidos microscopios electrónicos (Université Paris Sud)
Historia
  • Enlaces de historia de microscopía del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Alabama
  • Historia del microscopio electrónico de barrido ambiental (ESEM)
Imagenes
  • Instalación de microscopio electrónico Rippel Muchas docenas de imágenes SEM (en su mayoría biológicas) de Dartmouth College.
  • Imágenes SEM de tinción lantanoide del Instituto de Investigación de Enfermedades Oculares, Moscú.