Microscopio de transmisión por electrones

La microscopía electrónica de transmisión ( TEM ) es una técnica de microscopía en la que un haz de electrones se transmite a través de una muestra para formar una imagen. La muestra suele ser una sección ultrafina de menos de 100 nm de espesor o una suspensión en una rejilla. Se forma una imagen a partir de la interacción de los electrones con la muestra a medida que el haz se transmite a través de la muestra. A continuación, la imagen se amplía y se enfoca en un dispositivo de formación de imágenes, como una pantalla fluorescente , una capa de película fotográfica o un sensor como un centelleador conectado a un dispositivo de carga acoplada .

Una imagen TEM de un grupo de poliovirus . El virus de la polio tiene 30 nm de diámetro. [1]
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Principio de funcionamiento de un microscopio electrónico de transmisión

Los microscopios electrónicos de transmisión son capaces de obtener imágenes con una resolución significativamente más alta que los microscopios ópticos , debido a la menor longitud de onda de De Broglie de los electrones. Esto permite que el instrumento capture detalles finos, incluso tan pequeños como una sola columna de átomos, que es miles de veces más pequeña que un objeto resoluble visto en un microscopio óptico. La microscopía electrónica de transmisión es un método analítico importante en las ciencias físicas, químicas y biológicas. Los TEM encuentran aplicación en la investigación del cáncer , la virología y la ciencia de los materiales , así como en la investigación de la contaminación , la nanotecnología y los semiconductores , pero también en otros campos como la paleontología y la palinología .

Los instrumentos TEM cuentan con una enorme variedad de modos de funcionamiento que incluyen imágenes convencionales, imágenes TEM de barrido (STEM), difracción, espectroscopía y combinaciones de estos. Incluso dentro de las imágenes convencionales, hay muchas formas fundamentalmente diferentes de producir contraste, llamadas "mecanismos de contraste de imagen". El contraste puede surgir de las diferencias de posición a posición en el espesor o densidad ("contraste de espesor de masa"), número atómico ("contraste Z", refiriéndose a la abreviatura común Z para número atómico), estructura u orientación cristalina ("contraste cristalográfico contraste "o" contraste de difracción "), los ligeros cambios de fase de la mecánica cuántica que los átomos individuales producen en los electrones que los atraviesan (" contraste de fase "), la energía perdida por los electrones al pasar a través de la muestra (" imagen de espectro ") y más. Cada mecanismo le dice al usuario un tipo diferente de información, dependiendo no solo del mecanismo de contraste, sino también de cómo se usa el microscopio: la configuración de las lentes, las aperturas y los detectores. Lo que esto significa es que un TEM es capaz de devolver una variedad extraordinaria de información de resolución nanométrica y atómica, en casos ideales, revelando no solo dónde están todos los átomos, sino qué tipos de átomos son y cómo están unidos entre sí. Por esta razón, TEM se considera una herramienta esencial para la nanociencia tanto en el campo biológico como en el de los materiales.

El primer TEM fue demostrado por Max Knoll y Ernst Ruska en 1931, con este grupo desarrollando el primer TEM con una resolución mayor que la de la luz en 1933 y el primer TEM comercial en 1939. En 1986, Ruska recibió el Premio Nobel de Física por el desarrollo de la microscopía electrónica de transmisión. [2]

Desarrollo inicial

El primer TEM práctico, instalado originalmente en IG Farben-Werke y ahora en exhibición en el Deutsches Museum de Munich, Alemania.
Un microscopio electrónico de transmisión (1976).

En 1873, Ernst Abbe propuso que la capacidad de resolver detalles en un objeto estaba limitada aproximadamente por la longitud de onda de la luz utilizada en la formación de imágenes o unos pocos cientos de nanómetros para microscopios de luz visible. Los avances en microscopios ultravioleta (UV), liderados por Köhler y Rohr , aumentaron el poder de resolución en un factor de dos. [3] Sin embargo, esto requería costosas ópticas de cuarzo, debido a la absorción de UV por el vidrio. Se creía que no era posible obtener una imagen con información submicrométrica debido a esta restricción de longitud de onda. [4]

En 1858, Plücker observó la desviación de "rayos catódicos" ( electrones ) por campos magnéticos. [5] Este efecto fue utilizado por Ferdinand Braun en 1897 para construir dispositivos de medición de osciloscopios de rayos catódicos (CRO) simples . [6] En 1891, Riecke notó que los rayos catódicos podían ser enfocados por campos magnéticos, permitiendo diseños simples de lentes electromagnéticos. En 1926, Hans Busch publicó un trabajo ampliando esta teoría y demostró que la ecuación del fabricante de lentes podría, con supuestos apropiados, aplicarse a los electrones. [2]

En 1928, en la Universidad Técnica de Berlín , Adolf Matthias, profesor de tecnología de alto voltaje e instalaciones eléctricas, nombró a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en el diseño de CRO. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, incluidos Ernst Ruska y Bodo von Borries . El equipo de investigación trabajó en el diseño de lentes y la colocación de columnas de CRO, para optimizar los parámetros para construir mejores CRO y hacer componentes ópticos de electrones para generar imágenes de bajo aumento (casi 1: 1). En 1931, el grupo generó con éxito imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre la apertura del ánodo. El dispositivo utilizó dos lentes magnéticos para lograr aumentos más altos, posiblemente creando el primer microscopio electrónico . Ese mismo año, Reinhold Rudenberg , director científico de la empresa Siemens , patentó un microscopio electrónico de lente electrostática . [4] [7]

Mejorando la resolución

En ese momento, se entendía que los electrones eran partículas cargadas de materia; la naturaleza ondulatoria de los electrones no se comprendió por completo hasta la publicación de la hipótesis de De Broglie en 1927. [8] El grupo de investigación de Knoll no conoció esta publicación hasta 1932, cuando rápidamente se dieron cuenta de que la longitud de onda de De Broglie de los electrones era de muchos órdenes de magnitud. más pequeño que el de la luz, lo que teóricamente permite obtener imágenes a escalas atómicas. (Incluso para electrones con una energía cinética de solo 1 voltio, la longitud de onda ya es tan corta como 1,23  nm .) En abril de 1932, Ruska sugirió la construcción de un nuevo microscopio electrónico para obtener imágenes directas de muestras insertadas en el microscopio, en lugar de una simple malla. cuadrículas o imágenes de aberturas. Con este dispositivo se logró una difracción exitosa y una imagen normal de una hoja de aluminio. Sin embargo, el aumento alcanzable fue menor que con microscopía óptica. En septiembre de 1933 se lograron aumentos superiores a los disponibles con un microscopio óptico con imágenes de fibras de algodón adquiridas rápidamente antes de ser dañadas por el haz de electrones. [4]

En este momento, el interés por el microscopio electrónico había aumentado, con otros grupos, como el de Paul Anderson y Kenneth Fitzsimmons de la Universidad Estatal de Washington [9] y el de Albert Prebus y James Hillier en la Universidad de Toronto , quienes construyeron el primer TEM en América del Norte en 1935 y 1938, respectivamente, [10] avanzando continuamente el diseño de TEM.

Continuó la investigación sobre el microscopio electrónico en Siemens en 1936, donde el objetivo de la investigación era el desarrollo y la mejora de las propiedades de obtención de imágenes TEM, en particular con respecto a las muestras biológicas. En ese momento se estaban fabricando microscopios electrónicos para grupos específicos, como el dispositivo "EM1" utilizado en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido. [11] En 1939, el primer microscopio electrónico comercial, en la foto, fue instalado en el departamento de Física de IG Farben -Werke. El trabajo adicional en el microscopio electrónico se vio obstaculizado por la destrucción de un nuevo laboratorio construido en Siemens por un ataque aéreo , así como por la muerte de dos de los investigadores, Heinz Müller y Friedrick Krause durante la Segunda Guerra Mundial . [12]

Más investigación

Después de la Segunda Guerra Mundial, Ruska reanudó su trabajo en Siemens, donde continuó desarrollando el microscopio electrónico, produciendo el primer microscopio con un aumento de 100k. [12] La estructura fundamental de este diseño de microscopio, con ópticas de preparación de haz de múltiples etapas, todavía se utiliza en microscopios modernos. La comunidad mundial de microscopía electrónica avanzó con los microscopios electrónicos que se fabrican en Manchester, Reino Unido, EE. UU. (RCA), Alemania (Siemens) y Japón (JEOL). La primera conferencia internacional sobre microscopía electrónica se celebró en Delft en 1949, con más de cien asistentes. [11] Las conferencias posteriores incluyeron la "Primera" conferencia internacional en París, 1950 y luego en Londres en 1954.

Con el desarrollo de TEM, la técnica asociada de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) se volvió a investigar y permaneció sin desarrollar hasta la década de 1970, con Albert Crewe en la Universidad de Chicago desarrollando la pistola de emisión de campo [13] y agregando un objetivo de alta calidad lente para crear el STEM moderno. Con este diseño, Crewe demostró la capacidad de obtener imágenes de átomos utilizando imágenes anulares de campo oscuro . Crewe y sus colaboradores de la Universidad de Chicago desarrollaron la fuente de emisión de electrones de campo frío y construyeron un STEM capaz de visualizar átomos pesados ​​individuales en sustratos delgados de carbono. [14] En 2008, Jannick Meyer et al. describieron la visualización directa de átomos de luz como el carbono e incluso el hidrógeno utilizando TEM y un sustrato de grafeno de una sola capa limpio. [15]

Electrones

Teóricamente, la resolución máxima, d , que se puede obtener con un microscopio óptico ha estado limitada por la longitud de onda de los fotones (λ) que se utilizan para sondear la muestra y la apertura numérica NA del sistema. [dieciséis]

donde n es el índice de refracción del medio en el que está trabajando la lente y α es el medio ángulo máximo del cono de luz que puede entrar en la lente (ver apertura numérica ). [17] Los científicos de principios del siglo XX teorizaron formas de sortear las limitaciones de la longitud de onda relativamente grande de la luz visible (longitudes de onda de 400 a 700 nanómetros ) mediante el uso de electrones. Como toda materia, los electrones tienen propiedades tanto de onda como de partícula (como teorizó Louis-Victor de Broglie ), y sus propiedades ondulatorias significan que un haz de electrones puede enfocarse y difractarse de manera muy similar a la luz. La longitud de onda de los electrones está relacionada con su energía cinética a través de la ecuación de De Broglie, que dice que la longitud de onda es inversamente proporcional al momento. Teniendo en cuenta los efectos relativistas (como en un TEM la velocidad de un electrón es una fracción sustancial de la velocidad de la luz,  c [18] ) la longitud de onda es

donde, h es la constante de Planck , m 0 es la masa en reposo de un electrón y E es la energía cinética del electrón acelerado. Los electrones generalmente se generan en un microscopio electrónico mediante un proceso conocido como emisión termoiónica de un filamento, generalmente tungsteno, de la misma manera que una bombilla , o alternativamente por emisión de campo de electrones . [19] Los electrones son luego acelerados por un potencial eléctrico (medido en voltios ) y enfocados por lentes electrostáticos y electromagnéticos sobre la muestra. El haz transmitido contiene información sobre la densidad, la fase y la periodicidad de los electrones ; este rayo se utiliza para formar una imagen.

Fuente de electrones

Disposición de componentes ópticos en un TEM básico
Filamento de tungsteno estilo horquilla
Cristal único LaB _ 6 filamento

De arriba hacia abajo, el TEM consiste en una fuente de emisión o cátodo, que puede ser un filamento o aguja de tungsteno , o una fuente de cristal único de hexaboruro de lantano ( LaB 6 ) . [20] La pistola está conectada a una fuente de alto voltaje (típicamente ~ 100-300 kV) y, con suficiente corriente, la pistola comenzará a emitir electrones ya sea por emisión termoiónica o de campo de electrones al vacío. En el caso de una fuente termoiónica, la fuente de electrones se monta típicamente en un cilindro Wehnelt para proporcionar un enfoque preliminar de los electrones emitidos en un haz mientras también estabiliza la corriente usando un circuito de retroalimentación pasiva. En su lugar, una fuente de emisión de campo utiliza electrodos electrostáticos llamados extractores, supresores y lentes de pistola, con diferentes voltajes en cada uno, para controlar la forma y la intensidad del campo eléctrico cerca de la punta afilada. La combinación del cátodo y estos primeros elementos de lente electrostática a menudo se denomina colectivamente "cañón de electrones". Una vez que sale de la pistola, el rayo suele acelerarse mediante una serie de placas electrostáticas hasta que alcanza su voltaje final y entra en la siguiente parte del microscopio: el sistema de lentes de condensador. Estas lentes superiores del TEM luego enfocan aún más el haz de electrones al tamaño y ubicación deseados en la muestra. [21]

La manipulación del haz de electrones se realiza mediante dos efectos físicos. La interacción de los electrones con un campo magnético hará que los electrones se muevan de acuerdo con la regla de la mano izquierda , lo que permitirá que los electroimanes manipulen el haz de electrones. El uso de campos magnéticos permite la formación de una lente magnética de potencia de enfoque variable, la forma de la lente se origina debido a la distribución del flujo magnético. Además, los campos electrostáticos pueden hacer que los electrones se desvíen en un ángulo constante. El acoplamiento de dos deflexiones en direcciones opuestas con un pequeño espacio intermedio permite la formación de un cambio en la trayectoria del haz, lo que permite el cambio del haz en TEM, que es importante para STEM . A partir de estos dos efectos, así como del uso de un sistema de formación de imágenes electrónicas, es posible un control suficiente sobre la trayectoria del haz para el funcionamiento de TEM. La configuración óptica de un TEM se puede cambiar rápidamente, a diferencia de la de un microscopio óptico, ya que las lentes en la trayectoria del haz pueden activarse, cambiar su intensidad o desactivarse de forma totalmente sencilla mediante una conmutación eléctrica rápida, cuya velocidad está limitada por efectos como la histéresis magnética de las lentes.

Óptica

Las lentes de un TEM son lo que le da la flexibilidad de los modos de funcionamiento y la capacidad de enfocar los rayos hasta la escala atómica y ampliarlos para obtener una imagen en una cámara. Una lente generalmente está hecha de una bobina de solenoide casi rodeada de materiales ferromagnéticos diseñados para concentrar el campo magnético de la bobina en una forma precisa y confinada. Cuando un electrón entra y sale de este campo magnético, gira en espiral alrededor de las líneas curvas del campo magnético de una manera que actúa de manera muy similar a como lo hace una lente de vidrio ordinaria para la luz: es una lente convergente. Pero, a diferencia de una lente de vidrio, una lente magnética puede cambiar muy fácilmente su poder de enfoque simplemente ajustando la corriente que pasa a través de las bobinas. Esto proporciona una flexibilidad de funcionamiento que se multiplica aún más cuando las lentes se ensamblan en pilas de lentes independientes, cada una de las cuales puede enfocar, desenfocar, ampliar y / o colimar el haz procedente de la lente anterior. Esto permite que un sistema de lente única, entre la fuente y la muestra (el sistema de "lente de condensador") produzca un rayo paralelo de más de 1 milímetro de diámetro, un rayo estrechamente enfocado más pequeño que un átomo, o cualquier cosa en el medio. Una pila de lentes adicional, el sistema de lentes "intermedio / proyector", está después de la muestra. Se puede ajustar para producir un patrón de difracción enfocado o una imagen de la muestra con un aumento que varía en un amplio rango. Muchos microscopios individuales pueden cubrir el rango de aumento desde aproximadamente 100X hasta más de 1,000,000X.

Igualmente importantes para las lentes son las aperturas. Estos son agujeros circulares en tiras delgadas de metal pesado, colocados en puntos bien elegidos en la columna de lentes. Algunos tienen un tamaño y una posición fijos y juegan un papel importante en la limitación de la generación de rayos X y en la mejora del rendimiento del vacío. También evitan que los electrones pasen a través de las partes más externas de las lentes magnéticas que, debido a las grandes aberraciones de la lente, enfocan los haces de electrones de manera extremadamente pobre. Otros se pueden cambiar libremente entre varios tamaños diferentes y ajustar sus posiciones. Estas "aberturas variables" se utilizan para determinar la corriente del haz que llega a la muestra y también para mejorar la capacidad de enfocar el haz. Las aberturas variables después de la posición de la muestra permiten además al usuario seleccionar el rango de posiciones espaciales o ángulos de dispersión de electrones que se utilizarán en la formación de una imagen o un patrón de difracción. Si se utilizan hábilmente, estas aberturas permiten un estudio notablemente preciso y detallado de los defectos en los cristales.

El sistema electrónico-óptico también incluye deflectores y estigmadores, generalmente hechos de pequeños electroimanes. A diferencia de las lentes, los campos magnéticos producidos por los deflectores están orientados principalmente para desviar el haz y no para enfocarlo. Los deflectores permiten controlar de forma independiente la posición y el ángulo del haz en la posición de la muestra (como es esencial para STEM) y también garantizan que los haces permanezcan cerca de los centros de baja aberración de cada lente en las pilas de lentes. Los estigmadores proporcionan un enfoque fino auxiliar que compensa las imperfecciones leves y las aberraciones que causan el astigmatismo, una lente que tiene una fuerza focal diferente en diferentes direcciones.

Normalmente, un TEM consta de tres etapas de lente. Las etapas son las lentes de condensador, las lentes de objetivo y las lentes del proyector. Las lentes condensadoras son responsables de la formación del haz primario, mientras que las lentes objetivo enfocan el haz que atraviesa la muestra en sí (en el modo de escaneo STEM, también hay lentes objetivo sobre la muestra para hacer convergente el haz de electrones incidente). Las lentes del proyector se utilizan para expandir el haz sobre la pantalla de fósforo u otro dispositivo de imágenes, como una película. La ampliación del TEM se debe a la relación de las distancias entre la muestra y el plano de imagen de la lente del objetivo. [22] Los estigmadores adicionales permiten la corrección de las distorsiones asimétricas del haz, conocidas como astigmatismo . Se observa que las configuraciones ópticas TEM difieren significativamente con la implementación, y los fabricantes utilizan configuraciones de lentes personalizadas, como en instrumentos con corrección de aberración esférica , [21] o TEM que utilizan filtrado de energía para corregir la aberración cromática electrónica .

Reciprocidad

El teorema de reciprocidad óptica, o principio de reciprocidad de Helmholtz , generalmente es válido para los electrones dispersos elásticamente en un medio absorbente, como suele ser el caso en condiciones de funcionamiento TEM estándar. [23] [24] El teorema establece que la amplitud de onda en algún punto B como resultado de la fuente puntual de electrones A sería la misma que la amplitud en A debido a una fuente puntual equivalente colocada en B. [24] En pocas palabras, la función de onda para los electrones enfocados a través de cualquier serie de componentes ópticos que incluya solo campos escalares (es decir, no magnéticos) será exactamente equivalente si la fuente de electrones y el punto de observación se invierten.

En un TEM, se ha demostrado que las lentes electromagnéticas no interfieren notablemente con las observaciones de reciprocidad, [23] siempre que los procesos de dispersión elástica dominen en la muestra y la muestra no sea fuertemente magnética. La aplicación cuidadosa del teorema de reciprocidad en los casos en que es válido proporciona al usuario de TEM una flexibilidad considerable para tomar e interpretar imágenes y patrones de difracción de electrones. La reciprocidad también se puede utilizar para comprender la microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) en el contexto familiar de TEM, y para obtener e interpretar imágenes utilizando STEM.

Display y detectores

Los factores clave al considerar la detección de electrones incluyen la eficiencia cuántica de detección (DQE) , la función de dispersión de puntos (PSF) , la función de transferencia de modulación (MTF) , el tamaño de píxel y el tamaño de la matriz, el ruido, la velocidad de lectura de datos y la dureza de la radiación. [25]

Sistemas de imágenes en un TEM consisten en un pantalla de fósforo , que puede estar hecho de bien (10-100 micras) de partículas de zinc sulfuro , por la observación directa por el operador, y, opcionalmente, un sistema de grabación de imágenes tal como una película fotográfica , [26] CCD acoplados con pantalla YAG dopados , [27] u otro detector digital. [25] Normalmente, estos dispositivos pueden ser retirados o insertados en la trayectoria del haz por el operador según sea necesario. Si bien la película fotográfica puede registrar información de alta resolución, no es fácil de automatizar y los resultados no se pueden ver en tiempo real. El primer informe sobre el uso de un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) para TEM fue en 1982, [28] pero la tecnología no encontró un uso generalizado hasta finales de la década de 1990 y principios de la de 2000. [29] Los sensores monolíticos de píxeles activos (MAPS) también se utilizaron en TEM. [30] Los detectores CMOS , que son más rápidos y más resistentes al daño por radiación que los CCD, se han utilizado para TEM desde 2005. [31] [32] A principios de la década de 2010, un mayor desarrollo de la tecnología CMOS permitió la detección de recuentos de un solo electrón. ("modo de conteo"). [33] [34] Estos detectores de electrones directos están disponibles en Gatan , FEI y Direct Electron . [30]

La fuente de electrones del TEM está en la parte superior, donde el sistema de lentes (4, 7 y 8) enfoca el haz en la muestra y luego lo proyecta en la pantalla de visualización (10). El control de haz está a la derecha (13 y 14)

Un TEM está compuesto por varios componentes, que incluyen un sistema de vacío en el que viajan los electrones, una fuente de emisión de electrones para la generación de la corriente de electrones, una serie de lentes electromagnéticos, así como placas electrostáticas. Los dos últimos permiten al operador guiar y manipular el rayo según sea necesario. También se requiere un dispositivo que permita la inserción, el movimiento dentro y la extracción de muestras de la trayectoria del haz. Los dispositivos de imágenes se utilizan posteriormente para crear una imagen a partir de los electrones que salen del sistema.

Sistema de vacío

Para aumentar la trayectoria libre media de la interacción entre electrones y gases, se evacua un TEM estándar a presiones bajas, típicamente del orden de 10 -4 Pa . [35] La necesidad de esto es doble: primero, la tolerancia para la diferencia de voltaje entre el cátodo y el suelo sin generar un arco, y en segundo lugar, para reducir la frecuencia de colisión de electrones con átomos de gas a niveles insignificantes; este efecto se caracteriza por la significa camino libre . Los componentes TEM, como los portamuestras y los cartuchos de película, deben insertarse o reemplazarse de manera rutinaria, lo que requiere un sistema con la capacidad de volver a evacuar de manera regular. Como tal, los TEM están equipados con múltiples sistemas de bombeo y esclusas de aire y no están sellados al vacío de forma permanente.

El sistema de vacío para evacuar un TEM a un nivel de presión de funcionamiento consta de varias etapas. Inicialmente, un bajo o desbaste de vacío se logra ya sea con una bomba rotativa de paletas o de membrana Bombas de ajuste de una presión suficientemente baja para permitir la operación de un turbo-molecular o bomba de difusión que se establece el nivel de vacío alto necesario para las operaciones. Para permitir que la bomba de bajo vacío no requiera un funcionamiento continuo, mientras se operan continuamente las bombas turbomoleculares, el lado de vacío de una bomba de baja presión puede conectarse a cámaras que acomodan los gases de escape de la bomba turbomolecular. [36] Las secciones del TEM pueden aislarse mediante el uso de aberturas de limitación de presión para permitir diferentes niveles de vacío en áreas específicas, como un vacío más alto de 10 −4 a 10 −7 Pa o más en el cañón de electrones en altas temperaturas. TEM de resolución o emisión de campo.

Los TEM de alto voltaje requieren vacíos ultra altos en el rango de 10 −7 a 10 −9 Pa para evitar la generación de un arco eléctrico, particularmente en el cátodo TEM. [37] Como tal, para TEM de voltaje más alto, puede funcionar un tercer sistema de vacío, con la pistola aislada de la cámara principal mediante válvulas de compuerta o una abertura de bombeo diferencial, un pequeño orificio que evita la difusión de moléculas de gas en el área superior de la pistola de vacío. más rápido de lo que se pueden bombear. Para estas presiones muy bajas, se utiliza una bomba de iones o un material absorbente .

Un vacío deficiente en un TEM puede causar varios problemas que van desde la deposición de gas dentro del TEM sobre la muestra mientras se ve en un proceso conocido como deposición inducida por haz de electrones hasta daños más graves en el cátodo causados ​​por descargas eléctricas. [37] El uso de una trampa fría para adsorber gases sublimados en la vecindad de la muestra elimina en gran medida los problemas de vacío causados ​​por la sublimación de la muestra . [36]

Etapa de la muestra

Soporte de muestra TEM "rejilla" de malla, con secciones de ultramicrotomía

Los diseños de platina de muestras TEM incluyen esclusas de aire para permitir la inserción del portamuestras en el vacío con una pérdida mínima de vacío en otras áreas del microscopio. Los portamuestras sostienen un tamaño estándar de rejilla de muestra o muestra autoportante. Los tamaños de rejilla TEM estándar son de 3,05 mm de diámetro, con un grosor y un tamaño de malla que van desde unos pocos hasta 100 μm. La muestra se coloca sobre el área de malla que tiene un diámetro de aproximadamente 2,5 mm. Los materiales habituales de la rejilla son cobre, molibdeno, oro o platino. Esta rejilla se coloca en el portamuestras, que se empareja con la platina para muestras. Existe una amplia variedad de diseños de etapas y soportes, dependiendo del tipo de experimento que se realice. Además de las rejillas de 3,05 mm, a veces, aunque raras veces, se utilizan rejillas de 2,3 mm. Estas rejillas se usaron particularmente en las ciencias minerales donde se puede requerir un gran grado de inclinación y donde el material de la muestra puede ser extremadamente raro. Las muestras transparentes a los electrones tienen un grosor generalmente inferior a 100 nm, pero este valor depende del voltaje de aceleración.

Una vez insertada en un TEM, la muestra debe manipularse para ubicar la región de interés para el haz, como en la difracción de un solo grano , en una orientación específica. Para adaptarse a esto, la etapa TEM permite el movimiento de la muestra en el plano XY, el ajuste de altura Z y, por lo general, una sola dirección de inclinación paralela al eje de los soportes de entrada lateral. La rotación de la muestra puede estar disponible en soportes y etapas de difracción especializados. Algunos TEM modernos ofrecen la posibilidad de dos ángulos de movimiento de inclinación ortogonales con diseños de soportes especializados denominados soportes de muestras de doble inclinación. Algunos diseños de etapa, como las etapas de inserción vertical o de entrada superior que alguna vez fueron comunes para los estudios TEM de alta resolución, pueden simplemente tener disponible la traducción XY. Los criterios de diseño de las etapas TEM son complejos, debido a los requisitos simultáneos de restricciones mecánicas y electrón-ópticas y se dispone de modelos especializados para diferentes métodos.

Se requiere una etapa TEM para tener la capacidad de sostener una muestra y ser manipulada para llevar la región de interés a la trayectoria del haz de electrones. Como el TEM puede operar en una amplia gama de aumentos, la platina debe ser simultáneamente altamente resistente a la desviación mecánica, con requisitos de desviación tan bajos como unos pocos nm / minuto y poder moverse varios μm / minuto, con una precisión de reposicionamiento en el orden. de nanómetros. [38] Los diseños anteriores de TEM lograron esto con un conjunto complejo de dispositivos mecánicos de bajada, lo que permite al operador controlar con precisión el movimiento de la platina mediante varias varillas giratorias. Los dispositivos modernos pueden usar diseños de escenario eléctricos, usando engranajes de tornillo en concierto con motores paso a paso , proporcionando al operador una entrada de escenario basada en computadora, como un joystick o trackball .

Existen dos diseños principales para escenarios en un TEM, la versión de entrada lateral y la versión de entrada superior. [27] Cada diseño debe acomodar el soporte correspondiente para permitir la inserción de la muestra sin dañar la delicada óptica TEM o permitir la entrada de gas en los sistemas TEM al vacío.

Un diagrama de un portamuestras inclinable de un solo eje para su inserción en un goniómetro TEM. La inclinación del soporte se logra mediante la rotación de todo el goniómetro.

El más común es el soporte de entrada lateral, donde la muestra se coloca cerca de la punta de una varilla larga de metal (latón o acero inoxidable), con la muestra colocada plana en un pequeño orificio. A lo largo de la varilla hay varios anillos de vacío de polímero para permitir la formación de un sello de vacío de calidad suficiente, cuando se inserta en la plataforma. Por lo tanto, la plataforma está diseñada para acomodar la varilla, colocando la muestra entre o cerca de la lente del objetivo, dependiendo del diseño del objetivo. Cuando se inserta en el escenario, el soporte de entrada lateral tiene su punta contenida dentro del vacío TEM, y la base se presenta a la atmósfera, la esclusa de aire formada por los anillos de vacío.

Los procedimientos de inserción para los soportes TEM de entrada lateral generalmente implican la rotación de la muestra para activar microinterruptores que inician la evacuación de la esclusa de aire antes de que la muestra se inserte en la columna TEM.

El segundo diseño es el soporte de entrada superior que consta de un cartucho de varios cm de largo con un orificio perforado en el eje del cartucho. La muestra se carga en el orificio, posiblemente utilizando un pequeño anillo de rosca para mantener la muestra en su lugar. Este cartucho se inserta en una esclusa de aire con el orificio perpendicular al eje óptico TEM. Cuando está sellada, la esclusa de aire se manipula para empujar el cartucho de modo que el cartucho caiga en su lugar, donde el orificio se alinea con el eje de la viga, de modo que la viga desciende por la cavidad del cartucho y entra en la muestra. Por lo general, estos diseños no pueden inclinarse sin bloquear la trayectoria del haz o interferir con la lente del objetivo. [27]

Pistola de electrones

Diagrama de sección transversal de un ensamblaje de cañón de electrones, que ilustra la extracción de electrones

El cañón de electrones está formado por varios componentes: el filamento, un circuito de polarización, una tapa Wehnelt y un ánodo de extracción. Al conectar el filamento a la fuente de alimentación del componente negativo, los electrones se pueden "bombear" desde el cañón de electrones a la placa del ánodo y la columna TEM, completando así el circuito. La pistola está diseñada para crear un haz de electrones que sale del ensamblaje en un ángulo dado, conocido como semiángulo de divergencia de la pistola, α. Al construir el cilindro de Wehnelt de tal manera que tenga una carga negativa más alta que el filamento mismo, los electrones que salen del filamento de manera divergente son, bajo un funcionamiento adecuado, forzados a un patrón convergente cuyo tamaño mínimo es el diámetro de cruce de la pistola.

La densidad de corriente de emisión termoiónica, J , se puede relacionar con la función de trabajo del material emisor a través de la ley de Richardson.

donde A es la constante de Richardson , Φ es la función de trabajo y T es la temperatura del material. [27]

Esta ecuación muestra que para lograr una densidad de corriente suficiente es necesario calentar el emisor, teniendo cuidado de no dañarlo por la aplicación de un calor excesivo. Por esta razón, se requieren materiales con un alto punto de fusión, como el tungsteno, o aquellos con una función de trabajo baja (LaB 6 ) para el filamento de la pistola. [39] Además, tanto el hexaboruro de lantano como las fuentes termoiónicas de tungsteno deben calentarse para lograr la emisión termoiónica, esto se puede lograr mediante el uso de una pequeña tira resistiva. Para evitar el choque térmico, a menudo se impone un retraso en la aplicación de corriente a la punta, para evitar que los gradientes térmicos dañen el filamento, el retraso suele ser de unos segundos para LaB 6 y significativamente menor para el tungsteno [ cita requerida ] .

Lente de electrones

Diagrama de una lente de diseño de pieza de polo dividido TEM

Las lentes de electrones están diseñadas para actuar de una manera que emula la de una lente óptica, al enfocar electrones paralelos a una distancia focal constante. Las lentes de electrones pueden funcionar de forma electrostática o magnética. La mayoría de lentes de electrones para TEM utilizan bobinas electromagnéticas para generar una lente convexa . El campo producido para la lente debe ser radialmente simétrico, ya que la desviación de la simetría radial de la lente magnética provoca aberraciones como el astigmatismo y empeora la aberración esférica y cromática . Las lentes de electrones se fabrican a partir de aleaciones de hierro, hierro-cobalto o níquel cobalto, [40] como la permalloy . Estos se seleccionan por sus propiedades magnéticas, como saturación magnética , histéresis y permeabilidad .

Los componentes incluyen el yugo, la bobina magnética, los polos, la pieza polar y el circuito de control externo. La pieza polar debe fabricarse de manera muy simétrica, ya que esto proporciona las condiciones de contorno para el campo magnético que forma la lente. Las imperfecciones en la fabricación de la pieza polar pueden inducir severas distorsiones en la simetría del campo magnético, lo que induce distorsiones que finalmente limitarán la capacidad de las lentes para reproducir el plano del objeto. Las dimensiones exactas del espacio, el diámetro interno de la pieza polar y la conicidad, así como el diseño general de la lente, a menudo se realizan mediante análisis de elementos finitos del campo magnético, considerando las limitaciones térmicas y eléctricas del diseño. [40]

Las bobinas que producen el campo magnético están ubicadas dentro del yugo de la lente. Las bobinas pueden contener una corriente variable, pero normalmente utilizan altos voltajes y, por lo tanto, requieren un aislamiento significativo para evitar cortocircuitos en los componentes de la lente. Se colocan distribuidores térmicos para asegurar la extracción del calor generado por la energía perdida por resistencia de los devanados de la bobina. Los devanados pueden enfriarse por agua, utilizando un suministro de agua enfriada para facilitar la eliminación de la alta resistencia térmica.

Aberturas

Las aberturas son placas metálicas anulares, a través de las cuales se pueden excluir los electrones que están más allá de una distancia fija del eje óptico . Estos consisten en un pequeño disco metálico que es lo suficientemente grueso para evitar que los electrones pasen a través del disco, mientras que permite los electrones axiales. Este permiso de los electrones centrales en un TEM causa dos efectos simultáneamente: en primer lugar, las aberturas disminuyen la intensidad del haz a medida que se filtran los electrones del haz, lo que puede ser deseable en el caso de muestras sensibles al haz. En segundo lugar, este filtrado elimina los electrones que están dispersos en ángulos altos, lo que puede deberse a procesos no deseados como aberraciones esféricas o cromáticas, o debido a la difracción de la interacción dentro de la muestra. [41]

Las aberturas son una abertura fija dentro de la columna, como en la lente del condensador, o son una abertura móvil, que puede insertarse o retirarse de la trayectoria del haz, o moverse en el plano perpendicular a la trayectoria del haz. Los conjuntos de apertura son dispositivos mecánicos que permiten la selección de diferentes tamaños de apertura, que el operador puede utilizar para compensar la intensidad y el efecto de filtrado de la apertura. Los conjuntos de apertura a menudo están equipados con micrómetros para mover la apertura, necesarios durante la calibración óptica.

Los métodos de obtención de imágenes en TEM utilizan la información contenida en las ondas de electrones que salen de la muestra para formar una imagen. Las lentes del proyector permiten el posicionamiento correcto de esta distribución de ondas de electrones en el sistema de visualización. La intensidad observada, I , de la imagen, asumiendo una calidad suficientemente alta del dispositivo de imagen, se puede aproximar como proporcional al valor absoluto cuadrado promediado en el tiempo de la amplitud de las funciones de onda del electrón, donde la onda que forma el haz de salida se denota por Ψ. [42]

Por lo tanto, diferentes métodos de obtención de imágenes intentan modificar las ondas de electrones que salen de la muestra de una manera que proporcione información sobre la muestra o el haz en sí. De la ecuación anterior, se puede deducir que la imagen observada depende no solo de la amplitud del haz, sino también de la fase de los electrones, [ aclaración necesaria ] aunque los efectos de fase a menudo pueden ignorarse a menores aumentos. Las imágenes de mayor resolución requieren muestras más delgadas y mayores energías de los electrones incidentes, lo que significa que ya no se puede considerar que la muestra absorbe electrones (es decir, a través del efecto de la ley de Beer). En cambio, la muestra puede modelarse como un objeto que no cambia la amplitud de la función de onda del electrón entrante, sino que modifica la fase de la onda entrante; en este modelo, la muestra se conoce como un objeto de fase pura. Para muestras suficientemente delgadas, los efectos de fase dominan la imagen, lo que complica el análisis de las intensidades observadas. [42] Para mejorar el contraste en la imagen, el TEM puede operarse con un ligero desenfoque para mejorar el contraste, debido a la convolución de la función de transferencia de contraste del TEM, [43] que normalmente disminuiría el contraste si la muestra no fuera un objeto de fase débil.

Vista esquemática de los modos de imagen y difracción en TEM.

La figura de la derecha muestra los dos modos de operación básicos de TEM: modos de imagen y difracción. En ambos casos la probeta se ilumina con el haz paralelo, formado por la conformación del haz de electrones con el sistema de lentes Condensador y apertura Condensador. Después de la interacción con la muestra, en la superficie de salida de la muestra existen dos tipos de electrones: no dispersos (que corresponderán al haz central brillante en el patrón de difracción) y electrones dispersos (que cambian sus trayectorias debido a la interacción con el material).

En el modo de imágenes, la apertura del objetivo se inserta en un plano focal posterior (BFP) de la lente del objetivo (donde se forman los puntos de difracción). Si utiliza la apertura del objetivo para seleccionar solo el haz central, los electrones transmitidos pasan a través de la apertura mientras que todos los demás se bloquean y se obtiene una imagen de campo brillante (imagen BF). Si permitimos la señal de un haz difractado, se recibe una imagen de campo oscuro (imagen DF). La señal seleccionada se amplía y se proyecta en una pantalla (o en una cámara) con la ayuda de lentes Intermedios y Proyectores. Se obtiene así una imagen de la muestra.

En el modo de Difracción, se puede usar una apertura de área seleccionada para determinar con mayor precisión el área de la muestra desde la cual se mostrará la señal. Al cambiar la fuerza de la corriente a la lente intermedia, el patrón de difracción se proyecta en una pantalla. La difracción es una herramienta muy poderosa para realizar una reconstrucción celular y la determinación de la orientación de los cristales.

Formación de contraste

El contraste entre dos áreas adyacentes en una imagen TEM se puede definir como la diferencia en las densidades de electrones en el plano de la imagen. Debido a la dispersión del haz incidente por la muestra, la amplitud y la fase de la onda del electrón cambian, lo que da como resultado un contraste de amplitud y un contraste de fase , correspondientemente. La mayoría de las imágenes tienen ambos componentes de contraste.

El contraste de amplitud se obtiene debido a la eliminación de algunos electrones antes del plano de la imagen. Durante su interacción con el espécimen, algunos de los electrones se perderán debido a la absorción, o debido a la dispersión en ángulos muy altos más allá de la limitación física del microscopio o son bloqueados por la apertura del objetivo. Si bien las dos primeras pérdidas se deben a la construcción de la muestra y el microscopio, el operador puede utilizar la apertura del objetivo para mejorar el contraste.

Demostración de contraste BF y DF. Imagen TEM de una película de Pt policristalina

La figura de la derecha muestra una imagen TEM (a) y el patrón de difracción correspondiente (b) de una película policristalina de Pt tomada sin una apertura del objetivo. Para mejorar el contraste en la imagen TEM, debe reducirse el número de haces dispersos visibles en el patrón de difracción. Esto se puede hacer seleccionando un área determinada en el plano focal posterior, como solo el haz central o un haz difractado específico (ángulo), o combinaciones de dichos haces. Al seleccionar intencionalmente una apertura objetivo que solo permite que el haz no difractado pase más allá del plano focal posterior (y hacia el plano de la imagen): se crea una imagen de campo brillante (BF) (c), mientras que si el haz central, no El haz difractado está bloqueado: se pueden obtener imágenes de campo oscuro (DF) como las que se muestran en (de). Las imágenes DF (de) se obtuvieron seleccionando los haces difractados indicados en el patrón de difracción con círculos (b) utilizando una apertura en el plano focal posterior. Los granos de los que se dispersan los electrones en estos puntos de difracción aparecen más brillantes. Se dan más detalles sobre la formación de contraste de difracción.

Hay dos tipos de contraste de amplitud: masa-espesor y contraste de difracción. Primero, consideremos el contraste de masa-espesor . Cuando el rayo ilumina dos áreas vecinas con poca masa (o espesor) y alta masa (o espesor), la región más pesada dispersa electrones en ángulos más grandes. Estos electrones fuertemente dispersos se bloquean en el modo BF TEM por la apertura del objetivo. Como resultado, las regiones más pesadas aparecen más oscuras en las imágenes BF (tienen baja intensidad). El contraste de masa-espesor es más importante para materiales amorfos no cristalinos.

El contraste de difracción se produce debido a una orientación cristalográfica específica de un grano. En tal caso, el cristal se encuentra en la denominada condición de Bragg, en la que los planos atómicos están orientados de tal manera que existe una alta probabilidad de dispersión. Por tanto, el contraste de difracción proporciona información sobre la orientación de los cristales en una muestra policristalina. Tenga en cuenta que en caso de que exista contraste de difracción, el contraste no se puede interpretar como debido a variaciones de masa o espesor.

Contraste de difracción

Micrografía electrónica de transmisión de dislocaciones en acero, que son fallas en la estructura de la red cristalina a escala atómica.

Las muestras pueden exhibir un contraste de difracción, por lo que el haz de electrones experimenta la dispersión de Bragg , que en el caso de una muestra cristalina, dispersa los electrones en ubicaciones discretas en el plano focal posterior . Al colocar las aberturas en el plano focal posterior, es decir, la abertura del objetivo, se pueden seleccionar (o excluir) las reflexiones de Bragg deseadas, por lo que solo las partes de la muestra que están provocando que los electrones se dispersen hacia las reflexiones seleccionadas terminarán proyectadas sobre el aparato de formación de imágenes.

Si las reflexiones que se seleccionan no incluyen el rayo no disperso (que aparecerá en el punto focal de la lente), entonces la imagen aparecerá oscura donde no haya dispersión de muestra en el pico seleccionado, como tal región sin una muestra. aparecerá oscuro. Esto se conoce como imagen de campo oscuro.

Los TEM modernos a menudo están equipados con soportes para muestras que permiten al usuario inclinar la muestra en un rango de ángulos para obtener condiciones de difracción específicas, y las aberturas colocadas sobre la muestra permiten al usuario seleccionar electrones que de otro modo serían difractados en una dirección particular. de entrar en la muestra.

Las aplicaciones de este método incluyen la identificación de defectos de celosía en cristales. Al seleccionar cuidadosamente la orientación de la muestra, es posible no solo determinar la posición de los defectos, sino también determinar el tipo de defecto presente. Si la muestra está orientada de modo que un plano en particular esté ligeramente inclinado hacia fuera del ángulo de difracción más fuerte (conocido como Ángulo de Bragg ), cualquier distorsión del plano del cristal que incline localmente el plano al ángulo de Bragg producirá variaciones de contraste particularmente fuertes. Sin embargo, los defectos que producen únicamente el desplazamiento de átomos que no inclinan el cristal al ángulo de Bragg (es decir, desplazamientos paralelos al plano del cristal) no producirán un fuerte contraste. [44]

Contraste de fase

La estructura cristalina también se puede investigar mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM), también conocida como contraste de fase . Cuando se utiliza una fuente de emisión de campo y una muestra de espesor uniforme, las imágenes se forman debido a las diferencias en la fase de las ondas de electrones, que es causada por la interacción de la muestra. [43] La formación de imágenes viene dada por el módulo complejo de los haces de electrones entrantes. Como tal, la imagen no solo depende del número de electrones que golpean la pantalla, lo que hace que la interpretación directa de las imágenes de contraste de fase sea más compleja. Sin embargo, este efecto se puede utilizar con ventaja, ya que se puede manipular para proporcionar más información sobre la muestra, como en técnicas complejas de recuperación de fase .

Difracción

Patrón de difracción cristalino de un grano maclado de acero austenítico FCC

Como se indicó anteriormente, ajustando las lentes magnéticas de manera que el plano focal posterior de la lente en lugar del plano de formación de imágenes se coloque en el aparato de formación de imágenes, se puede generar un patrón de difracción . Para muestras cristalinas delgadas, esto produce una imagen que consiste en un patrón de puntos en el caso de un monocristal, o una serie de anillos en el caso de un material sólido policristalino o amorfo . Para el caso de monocristal, el patrón de difracción depende de la orientación de la muestra y la estructura de la muestra iluminada por el haz de electrones. Esta imagen proporciona al investigador información sobre las simetrías del grupo espacial en el cristal y la orientación del cristal a la trayectoria del haz. Por lo general, esto se hace sin utilizar ninguna información, excepto la posición en la que aparecen los puntos de difracción y las simetrías de la imagen observada.

Los patrones de difracción pueden tener un amplio rango dinámico y, para muestras cristalinas, pueden tener intensidades mayores que las que se pueden registrar con CCD. Como tal, los TEM aún pueden estar equipados con cartuchos de película con el fin de obtener estas imágenes, ya que la película es un detector de un solo uso.

Líneas Kikuchi de haz convergente de silicio, cerca del eje de la zona [100]

El análisis de los patrones de difracción más allá de la posición del punto puede ser complejo, ya que la imagen es sensible a varios factores, como el grosor y la orientación de la muestra, el desenfoque de la lente del objetivo y la aberración esférica y cromática. Aunque es posible la interpretación cuantitativa del contraste que se muestra en las imágenes de celosía, es intrínsecamente complicado y puede requerir una extensa simulación y análisis por computadora, como el análisis de múltiples cortes de electrones . [45]

También es posible un comportamiento más complejo en el plano de difracción, con fenómenos como las líneas de Kikuchi que surgen de la difracción múltiple dentro de la red cristalina. En la difracción de electrones de haz convergente (CBED), donde se produce un frente de onda de electrones no paralelo, es decir, convergente, al concentrar el haz de electrones en una sonda fina en la superficie de la muestra, la interacción del haz convergente puede proporcionar información más allá de los datos estructurales, como la muestra. grosor.

Espectroscopía de pérdida de energía electrónica (EELS)

Utilizando la técnica avanzada de espectroscopia de pérdida de energía de electrones (EELS), para los TEM debidamente equipados, los electrones se pueden separar en un espectro en función de su velocidad (que está estrechamente relacionada con su energía cinética y, por lo tanto, la pérdida de energía de la energía del haz), utilizando dispositivos basados ​​en sectores magnéticos conocidos como espectrómetros EEL. Estos dispositivos permiten la selección de valores de energía particulares, que pueden asociarse con la forma en que el electrón ha interactuado con la muestra. Por ejemplo, diferentes elementos en una muestra dan como resultado diferentes energías electrónicas en el haz después de la muestra. Esto normalmente da como resultado una aberración cromática; sin embargo, este efecto se puede usar, por ejemplo, para generar una imagen que proporcione información sobre la composición elemental, basada en la transición atómica durante la interacción electrón-electrón. [46]

Los espectrómetros EELS a menudo se pueden operar en modos espectroscópicos y de imágenes, lo que permite el aislamiento o el rechazo de haces dispersos elásticamente . Como para muchas imágenes, la dispersión inelástica incluirá información que puede no ser de interés para el investigador, reduciendo así las señales observables de interés, las imágenes EELS se pueden usar para mejorar el contraste en las imágenes observadas, incluyendo tanto el campo brillante como la difracción, rechazando componentes no deseados.

Imágenes tridimensionales

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Una imagen TEM tridimensional de un parapoxvirus [47]

Como los portamuestras TEM normalmente permiten la rotación de una muestra en un ángulo deseado, se pueden obtener múltiples vistas de la misma muestra girando el ángulo de la muestra a lo largo de un eje perpendicular al haz. Al tomar varias imágenes de una sola muestra de TEM en diferentes ángulos, generalmente en incrementos de 1 °, se puede recopilar un conjunto de imágenes conocido como "serie de inclinación". Esta metodología fue propuesta en la década de 1970 por Walter Hoppe . En condiciones puramente de contraste de absorción, este conjunto de imágenes se puede utilizar para construir una representación tridimensional de la muestra. [48]

La reconstrucción se logra mediante un proceso de dos pasos, las primeras imágenes se alinean para tener en cuenta los errores en el posicionamiento de una muestra; tales errores pueden ocurrir debido a vibraciones o desviaciones mecánicas. [49] Los métodos de alineación utilizan algoritmos de registro de imágenes, como los métodos de autocorrelación para corregir estos errores. En segundo lugar, utilizando un algoritmo de reconstrucción, como la retroproyección filtrada , los cortes de imagen alineados se pueden transformar de un conjunto de imágenes bidimensionales, I j ( x ,  y ), a una sola imagen tridimensional, I ' j ( x ,  y ,  z ). Esta imagen tridimensional es de particular interés cuando se requiere información morfológica; se pueden realizar más estudios utilizando algoritmos informáticos, como isosuperficies y corte de datos para analizar los datos.

Como las muestras de TEM generalmente no se pueden ver en una rotación completa de 180 °, las imágenes observadas generalmente sufren de una "cuña faltante" de datos, que cuando se utilizan métodos de retroproyección basados ​​en Fourier , disminuye el rango de frecuencias resolubles en la reconstrucción tridimensional. [48] Refinamientos mecánicos, como la inclinación de varios ejes (dos series de inclinación del mismo espécimen hechas en direcciones ortogonales) y la tomografía cónica (donde el espécimen se inclina primero a un ángulo fijo dado y luego se toman imágenes en incrementos de rotación angular iguales a través de un rotación completa en el plano de la cuadrícula de la muestra) se puede utilizar para limitar el impacto de los datos faltantes en la morfología de la muestra observada. Utilizando el fresado con haz de iones enfocado , se ha propuesto una nueva técnica [50] que utiliza una muestra en forma de pilar y un soporte de tomografía en el eje dedicado para realizar una rotación de 180 ° de la muestra dentro de la pieza polar de la lente del objetivo en TEM. Usando tales arreglos, es posible la tomografía electrónica cuantitativa sin la cuña faltante. [51] Además, existen técnicas numéricas que pueden mejorar los datos recopilados.

Todos los métodos mencionados anteriormente implican registrar series de inclinación de un campo de muestra dado. Esto inevitablemente da como resultado la suma de una alta dosis de electrones reactivos a través de la muestra y la consiguiente destrucción de detalles finos durante el registro. Por lo tanto, la técnica de imágenes de dosis baja (dosis mínima) se aplica regularmente para mitigar este efecto. La formación de imágenes de dosis baja se realiza desviando la iluminación y las regiones de formación de imágenes simultáneamente lejos del eje óptico para obtener una imagen de una región adyacente al área que se va a registrar (la región de dosis alta). Esta área se mantiene centrada durante la inclinación y se vuelve a enfocar antes de grabar. Durante el registro, las deflexiones se eliminan de modo que el área de interés se exponga al haz de electrones solo durante el tiempo necesario para la formación de imágenes. Una mejora de esta técnica (para objetos que descansan sobre una película de sustrato inclinada) es tener dos regiones simétricas fuera del eje para enfocar, seguidas de establecer el enfoque en el promedio de los dos valores de enfoque de dosis alta antes de registrar el área de interés de dosis baja. .

Las variantes no tomográficas de este método, denominado análisis de una sola partícula , utilizan imágenes de múltiples (con suerte) objetos idénticos en diferentes orientaciones para producir los datos de imagen necesarios para la reconstrucción tridimensional. Si los objetos no tienen orientaciones preferidas significativas, este método no sufre de la cuña (o cono) de datos que faltan que acompañan a los métodos tomográficos ni conlleva una dosis de radiación excesiva, sin embargo, asume que los diferentes objetos fotografiados pueden tratarse como si el Los datos 3D generados a partir de ellos surgieron de un solo objeto estable.

Una muestra de células (negro) teñidas con tetróxido de osmio y acetato de uranilo embebidas en resina epoxi (ámbar) lista para seccionar.

La preparación de muestras en TEM puede ser un procedimiento complejo. [52] Las muestras de TEM deben tener menos de 100 nanómetros de espesor para un TEM convencional. A diferencia de la radiación de neutrones o rayos X, los electrones del haz interactúan fácilmente con la muestra, un efecto que aumenta aproximadamente con el número atómico al cuadrado (Z 2 ). [16] Las muestras de alta calidad tendrán un grosor comparable al camino libre medio de los electrones que viajan a través de las muestras, que puede ser de solo unas pocas decenas de nanómetros. La preparación de las muestras TEM es específica del material que se analiza y del tipo de información que se obtendrá de la muestra.

Los materiales que tienen dimensiones lo suficientemente pequeñas como para ser transparentes a los electrones, como sustancias en polvo, organismos pequeños, virus o nanotubos, se pueden preparar rápidamente mediante la deposición de una muestra diluida que contiene la muestra sobre películas sobre rejillas de soporte. Las muestras biológicas se pueden incrustar en resina para resistir el alto vacío en la cámara de muestra y para permitir cortar tejido en secciones delgadas transparentes a los electrones. La muestra biológica se puede teñir usando un material de tinción negativo , como acetato de uranilo para bacterias y virus, o, en el caso de secciones incrustadas, la muestra puede teñirse con metales pesados, incluido el tetróxido de osmio. Alternativamente, las muestras pueden mantenerse a temperaturas de nitrógeno líquido después de incrustarlas en hielo vítreo. [53] En la ciencia de los materiales y la metalurgia, las muestras por lo general pueden resistir el alto vacío, pero aún deben prepararse como una lámina delgada o grabarse de manera que una parte de la muestra sea lo suficientemente delgada para que la viga penetre. Las restricciones sobre el espesor del material pueden estar limitadas por la sección transversal de dispersión de los átomos que componen el material.

Seccionamiento de tejido

Hoja de cuchillo de diamante que se utiliza para cortar secciones ultrafinas (normalmente de 70 a 350 nm) para microscopía electrónica de transmisión.

El tejido biológico a menudo se incrusta en un bloque de resina y luego se adelgaza a menos de 100 nm en un ultramicrótomo . El bloque de resina se fractura al pasar sobre un filo de cuchillo de vidrio o diamante. [54] Este método se utiliza para obtener muestras delgadas y mínimamente deformadas que permiten la observación de la ultraestructura del tejido. Las muestras inorgánicas, como el aluminio, también pueden incrustarse en resinas y seccionarse ultradelgadas de esta manera, usando vidrio revestido, zafiro o cuchillas de diamante de ángulo más grande. [55] Para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra cuando se visualiza en el TEM, las muestras de tejido deben recubrirse con una capa delgada de material conductor, como carbono.

Tinción de muestra

Una sección de una célula de Bacillus subtilis , tomada con un Tecnai T-12 TEM. La barra de escala es de 200 nm.

Las muestras TEM de tejidos biológicos necesitan tinciones de alto número atómico para mejorar el contraste. La mancha absorbe los electrones del haz o dispersa parte del haz de electrones que, de lo contrario, se proyecta sobre el sistema de imágenes. Se pueden usar compuestos de metales pesados como osmio , plomo , uranio u oro (en el marcaje inmunológico ) antes de la observación TEM para depositar selectivamente átomos densos en electrones en o sobre la muestra en la región celular o proteica deseada. Este proceso requiere una comprensión de cómo los metales pesados ​​se unen a estructuras celulares y tejidos biológicos específicos. [56]

Fresado mecánico

El pulido mecánico también se utiliza para preparar muestras para imágenes en el TEM. El pulido debe realizarse con una alta calidad, para garantizar un espesor de muestra constante en toda la región de interés. Se puede usar un compuesto de pulido de diamante o nitruro de boro cúbico en las etapas finales del pulido para eliminar cualquier rasguño que pueda causar fluctuaciones de contraste debido al grosor variable de la muestra. Incluso después de un fresado mecánico cuidadoso, pueden ser necesarios métodos finos adicionales, como el grabado iónico, para realizar el adelgazamiento de la etapa final.

Grabado químico

Ciertas muestras pueden prepararse mediante grabado químico, particularmente muestras metálicas. Estas muestras se diluyen usando un grabador químico, como un ácido, para preparar la muestra para la observación TEM. Los dispositivos para controlar el proceso de adelgazamiento pueden permitir al operador controlar el voltaje o la corriente que pasa a través de la muestra, y pueden incluir sistemas para detectar cuando la muestra se ha adelgazado a un nivel suficiente de transparencia óptica.

Grabado de iones

El grabado iónico es un proceso de pulverización catódica que puede eliminar cantidades muy finas de material. Se utiliza para realizar un pulido de acabado de muestras pulidas por otros medios. El grabado iónico utiliza un gas inerte que pasa a través de un campo eléctrico para generar una corriente de plasma que se dirige a la superficie de la muestra. Las energías de aceleración para gases como el argón son típicamente de unos pocos kilovoltios. La muestra se puede rotar para promover un pulido uniforme de la superficie de la muestra. La tasa de pulverización catódica de tales métodos es del orden de decenas de micrómetros por hora, lo que limita el método a un pulido extremadamente fino.

Se ha demostrado recientemente que el grabado iónico por gas argón puede archivar las estructuras de la pila MTJ en una capa específica que luego se ha resuelto atómicamente. Las imágenes TEM tomadas en vista en planta en lugar de en sección transversal revelan que la capa de MgO dentro de los MTJ contiene una gran cantidad de límites de grano que pueden estar disminuyendo las propiedades de los dispositivos. [57]

Fresado de iones

Imagen de microscopio electrónico de barrido de una muestra de TEM fina molida por FIB . La fina membrana que se muestra aquí es adecuada para el examen TEM; sin embargo, a un espesor de ~ 300 nm, no sería adecuado para TEM de alta resolución sin más fresado.

Más recientemente , se han utilizado métodos de haz de iones enfocados para preparar muestras. FIB es una técnica relativamente nueva para preparar muestras delgadas para el examen TEM a partir de muestras más grandes. Debido a que el FIB se puede utilizar para micro-mecanizar muestras con mucha precisión, es posible fresar membranas muy delgadas de un área específica de interés en una muestra, como un semiconductor o un metal. A diferencia de la pulverización catódica de iones de gas inerte, FIB utiliza iones de galio significativamente más energéticos y puede alterar la composición o estructura del material mediante la implantación de galio. [58]

Transferencia asistida con nanocables

Para una introducción mínima de tensión y flexión a las muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) ( laminillas , películas delgadas y otras muestras mecánicas y sensibles al haz), cuando se transfieren dentro de un haz de iones enfocado (FIB), se pueden unir nanocables metálicos flexibles a un micromanipulador típicamente rígido .

Las principales ventajas de este método incluyen una reducción significativa del tiempo de preparación de la muestra (soldadura rápida y corte de nanocables a baja corriente de haz) y minimización de flexión inducida por tensión, contaminación de Pt y daño por haz de iones. [59] Esta técnica es particularmente adecuada para la preparación de muestras de microscopía electrónica in situ .

Replicación

Imagen de réplica de platino de Staphylococcus aureus tomada en un TEM con un aumento de 50.000x.

Las muestras también se pueden replicar utilizando una película de acetato de celulosa , la película se recubre posteriormente con un metal pesado como el platino, la película original se disuelve y la réplica se visualiza en el TEM. Se utilizan variaciones de la técnica de réplica tanto para materiales como para muestras biológicas. En la ciencia de los materiales, un uso común es examinar la superficie de fractura fresca de las aleaciones metálicas.

Las capacidades del TEM se pueden ampliar aún más mediante etapas y detectores adicionales, a veces incorporados en el mismo microscopio.

TEM de escaneo

Un TEM se puede modificar en un microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) mediante la adición de un sistema que traza un haz convergente a través de la muestra para formar la imagen, cuando se combina con detectores adecuados. Las bobinas de exploración se utilizan para desviar el rayo, por ejemplo, mediante un desplazamiento electrostático del rayo, donde el rayo se recoge utilizando un detector de corriente como una copa de Faraday , que actúa como un contador de electrones directo. Al correlacionar el recuento de electrones con la posición del rayo de exploración (conocido como "sonda"), se puede medir el componente transmitido del rayo. Los componentes no transmitidos pueden obtenerse mediante la inclinación del haz o mediante el uso de detectores anulares de campo oscuro .

Diagrama de rayos esquemático que ilustra la reciprocidad óptica entre TEM (izquierda) y STEM (derecha). El ángulo de convergencia en TEM, , se convierte en el ángulo de recopilación en STEM, . Imagen inspirada en Hren et al. [60]

Básicamente, TEM y STEM están vinculados a través de la reciprocidad de Helmholtz . Un STEM es un TEM en el que la fuente de electrones y el punto de observación se han cambiado en relación con la dirección de desplazamiento del haz de electrones. Vea los diagramas de rayos en la figura de la derecha. El instrumento STEM se basa efectivamente en la misma configuración óptica que un TEM, pero funciona cambiando la dirección de viaje de los electrones (o invirtiendo el tiempo) durante el funcionamiento de un TEM. En lugar de usar una apertura para controlar los electrones detectados, como en TEM, un STEM usa varios detectores con ángulos de recolección que pueden ajustarse según los electrones que el usuario quiera capturar.

Microscopio electrónico de bajo voltaje

Un microscopio electrónico de bajo voltaje (LVEM) se opera a un voltaje de aceleración de electrones relativamente bajo entre 5 y 25 kV. Algunos de estos pueden ser una combinación de SEM, TEM y STEM en un solo instrumento compacto. El bajo voltaje aumenta el contraste de la imagen, lo que es especialmente importante para las muestras biológicas. Este aumento de contraste reduce significativamente o incluso elimina la necesidad de teñir. Son posibles resoluciones de unos pocos nm en los modos TEM, SEM y STEM. La baja energía del haz de electrones significa que los imanes permanentes se pueden usar como lentes y, por lo tanto, se puede usar una columna en miniatura que no requiere enfriamiento. [61] [62]

Cryo-TEM

Artículo principal: Criomicroscopía electrónica de transmisión.

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (Cryo-TEM) utiliza un TEM con un portamuestras capaz de mantener la muestra a temperaturas de nitrógeno líquido o helio líquido . Esto permite obtener imágenes de muestras preparadas en hielo vítreo , la técnica de preparación preferida para obtener imágenes de moléculas individuales o conjuntos macromoleculares , [63] obtener imágenes de interfaces vitrificadas sólido-electrolito, [64] y obtener imágenes de materiales que son volátiles en alto vacío a temperatura ambiente, como como azufre. [sesenta y cinco]

TEM ambiental / in situ

Los experimentos in situ también se pueden realizar en TEM utilizando cámaras de muestras con bombeo diferencial o soportes especializados. [66] Los tipos de experimentos in situ incluyen el estudio de nanomateriales, [67] muestras biológicas y reacciones químicas mediante microscopía electrónica de fase líquida , [68] [69] y pruebas de deformación del material. [70]

TEM con corrección de aberración

Los TEM de investigación modernos pueden incluir correctores de aberraciones , [21] para reducir la cantidad de distorsión en la imagen. También se pueden utilizar monocromadores de haz incidente que reducen la dispersión de energía del haz de electrones incidente a menos de 0,15  eV . [21] Los principales fabricantes de TEM con corrección de aberraciones incluyen JEOL , Hitachi High-Technologies, FEI Company y NION.

TEM ultrarrápido y dinámico

Es posible alcanzar una resolución temporal mucho más allá de la velocidad de lectura de los detectores de electrones con el uso de electrones pulsados . Los pulsos se pueden producir modificando la fuente de electrones para permitir la fotoemisión activada por láser [71] o mediante la instalación de un supresor de haz ultrarrápido. [72] Este enfoque se denomina microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida cuando se usa iluminación estroboscópica de bomba-sonda : una imagen se forma por la acumulación de muchos pulsos de electrones con un retraso de tiempo fijo entre la llegada del pulso de electrones y la excitación de la muestra. Por otro lado, el uso de una secuencia única o corta de pulsos de electrones con un número suficiente de electrones para formar una imagen de cada pulso se denomina microscopía electrónica de transmisión dinámica. La resolución temporal de hasta cientos de femtosegundos y la resolución espacial comparable a la disponible con una fuente de emisión de campo Schottky es posible en TEM ultrarrápido, [73] pero la técnica solo puede obtener imágenes de procesos reversibles que pueden ser reproducidos millones de veces. El TEM dinámico puede resolver procesos irreversibles hasta decenas de nanosegundos y decenas de nanómetros. [74]

Hay una serie de inconvenientes en la técnica TEM. Muchos materiales requieren una preparación de muestras extensa para producir una muestra lo suficientemente delgada como para ser transparente a los electrones, lo que hace que el análisis TEM sea un proceso relativamente lento con un bajo rendimiento de muestras. La estructura de la muestra también se puede cambiar durante el proceso de preparación. Además, el campo de visión es relativamente pequeño, lo que aumenta la posibilidad de que la región analizada no sea característica de toda la muestra. Existe la posibilidad de que el haz de electrones dañe la muestra, especialmente en el caso de materiales biológicos.

Límites de resolución

Evolución de la resolución espacial lograda con microscopios ópticos, de transmisión (TEM) y electrónicos con corrección de aberraciones (ACTEM). [75]

El límite de resolución que se puede obtener en un TEM puede describirse de varias formas, y normalmente se denomina límite de información del microscopio. Un valor comúnmente utilizado [ cita requerida ] es un valor de corte de la función de transferencia de contraste , una función que generalmente se cita en el dominio de la frecuencia para definir la reproducción de las frecuencias espaciales de los objetos en el plano del objeto por la óptica del microscopio. Una frecuencia de corte, q max , para la función de transferencia puede aproximarse con la siguiente ecuación, donde C s es el coeficiente de aberración esférica y λ es la longitud de onda del electrón: [41]

Para un microscopio de 200 kV, con aberraciones esféricas parcialmente corregidas ("hasta el tercer orden") y un valor de C s de 1 µm, [76] un valor de corte teórico podría ser 1 / q máx = 42  pm . [41] El mismo microscopio sin corrector tendría C s = 0,5 mm y, por lo tanto, un límite de 200 pm. [76] Las aberraciones esféricas se suprimen al tercer o quinto orden en los microscopios con " corrección de aberraciones ". Sin embargo, su resolución está limitada por la geometría y el brillo de la fuente de electrones y las aberraciones cromáticas en el sistema de lentes del objetivo. [21] [77]

La representación en el dominio de la frecuencia de la función de transferencia de contraste a menudo puede tener una naturaleza oscilatoria, [78] que se puede sintonizar ajustando el valor focal de la lente del objetivo. Esta naturaleza oscilatoria implica que algunas frecuencias espaciales son reflejadas fielmente por el microscopio, mientras que otras son suprimidas. Al combinar múltiples imágenes con diferentes frecuencias espaciales, el uso de técnicas como la reconstrucción de series focales se puede utilizar para mejorar la resolución del TEM de manera limitada. [41] La función de transferencia de contraste puede, hasta cierto punto, aproximarse experimentalmente a través de técnicas como la transformación de Fourier de imágenes de material amorfo, como el carbono amorfo .

Más recientemente, los avances en el diseño de correctores de aberraciones han logrado reducir las aberraciones esféricas [79] y lograr una resolución por debajo de 0,5 Ångströms (50 pm) [77] con aumentos superiores a 50 millones de veces. [80] La resolución mejorada permite obtener imágenes de átomos más ligeros que dispersan electrones de manera menos eficiente, como los átomos de litio en los materiales de las baterías de litio. [81] La capacidad de determinar la posición de los átomos dentro de los materiales ha convertido al HRTEM en una herramienta indispensable para la investigación y el desarrollo de la nanotecnología en muchos campos, incluida la catálisis heterogénea y el desarrollo de dispositivos semiconductores para electrónica y fotónica. [82]

  • Microscopía crioelectrónica
  • Difracción de electrones
  • Espectroscopía de pérdida de energía electrónica (EELS)
  • Microscopía electrónica de transmisión de energía filtrada (EFTEM)
  • Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM)
  • Microscopía electrónica de bajo voltaje (LVEM)
  • Difracción de electrones de precesión
  • Microscopía electrónica confocal de barrido

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  • El Centro Nacional de Microscopía Electrónica, Berkeley, California, EE. UU.
  • El Centro Nacional de Imágenes Macromoleculares, Houston, Texas, EE. UU.
  • The National Resource for Automated Molecular Microscopy, Nueva York, EE. UU.
  • Cursos tutoriales de microscopía electrónica de transmisión
  • Paquete de enseñanza y aprendizaje de la Universidad de Cambridge sobre TEM
  • Curso online sobre Microscopía Electrónica de Transmisión e Imperfecciones Cristalinas Eric Stach (2008).
  • Simulador de microscopio electrónico de transmisión (herramienta didáctica).
  • animaciones y explicaciones sobre varios tipos de microscopios, incluidos microscopios electrónicos (Université Paris Sud)