Se basa en la actividad de la enzima β-galactosidasa (β-gal), una enzima natural en las células de E. coli , que escinde las moléculas de lactosa en glucosa y galactosa. β-gal está codificado por el gen lacZ en el cromosoma bacteriano. También existe la cepa M15 de E. coli con una mutación por deleción de un fragmento del gen Lac que produce un β-gal inactivo (llamado ω-péptido). Debido al proceso de complementación α, E. colilas cepas con la mutación por deleción lacZΔM15 que porta el vector plasmídico que contiene la secuencia lacZα pueden producir la enzima β-gal funcional. Para examinar los clones con ADN recombinante, se añade al medio X-gal, isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) junto con un antibiótico (como ampicilina). X-gal es un sustrato cromogénico e IPTG es un análogo de galactosa que induce la expresión del gen lacZ. El vector de plásmido está diseñado para contener el sitio de clonación múltiple (MCS) presente dentro de la secuencia lacZ. En consecuencia, en el plásmido con un inserto (ADN extraño), no se produce la complementación α, por lo que no se forma una enzima β-galactosidasa funcional.
Las colonias azules contienen E. coli que produce una enzima funcional que hidroliza X-gal, dando como resultado un pigmento azul insoluble. En otras palabras, estas son bacterias sin el inserto que tienen un gen LacZ funcional.
Las colonias blancas se forman cuando la E. coli toma un vector plasmídico que contiene un inserto con ADN extraño (que interrumpe el gen lacZ) , no se produce la complementación α y, por lo tanto, no se produce la enzima funcional β-gal. A continuación, las colonias recombinantes blancas deseadas se pueden seleccionar y cultivar fácilmente.
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