zimografía de catepsina
La zimografía de catepsina es una técnica para cuantificar la actividad enzimática de la familia de las catepsinas de cisteína proteasas. Se basa en SDS-PAGE mediante el cual las muestras analizadas para actividad de catepsina se cargan en un gel de poliacrilamida y luego se separan por peso molecular. La gelatina está incrustada en el propio gel, proporcionando un sustrato para que las enzimas se hidrolicen.
Mientras que las proformas de las catepsinas son generalmente estables, una vez activadas, las proteasas como la catepsina K son vulnerables a la inactivación en ambientes de pH neutro. Esta pérdida de actividad complica la detección de estas enzimas. La zimografía, a través de su alta sensibilidad y naturaleza multiplex, permite la distinción simultánea entre múltiples catepsinas. Se pueden dilucidar cantidades muy pequeñas de actividad enzimática y es capaz de resolver un femtomol de actividad de catepsina K.
Las muestras de tejido se lisan en tampón suplementado con leupeptina para mantener la actividad enzimática. Las muestras se estandarizan para la concentración de proteína y luego se cargan en un gel de poliacrilamida para SDS-PAGE. Una vez completada la separación de proteínas por peso molecular, el gel se incuba en un tampón de renaturalización para restaurar la actividad enzimática. Durante la carga, se usó un tampón no reductor para preservar los enlaces disulfuro de proteína. Después del período de renaturalización, el gel se incuba en tampón de ensayo para permitir que las catepsinas ahora activas proteolicen la gelatina impregnada en el gel. Este proceso tiene lugar durante la noche. Al día siguiente, el gel se analiza en busca de regiones de degradación de gelatina mediante tinción con azul de Coomassie. Se observan parches de gel que ya no son azules después de un lavado de decoloración.Luego, estas bandas se correlacionan con sus pesos moleculares respectivos para identificar qué catepsinas estaban activas en la muestra.
