La microscopía de dispersión Coherente Raman (CRS) es una técnica de microscopía multifotónica basada en modos de moléculas vibracionales activos Raman . Las dos técnicas principales en microscopía CRS son la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) . SRS y CARS se predijeron teóricamente y se realizaron de forma experimental en la década de 1960. [1] [2] [3] En 1982 se demostró el primer microscopio CARS. [4] En 1999, la microscopía CARS que utiliza una geometría colineal y un objetivo de alta apertura numérica se desarrolló en el laboratorio de Xiaoliang Sunney Xie en la Universidad de Harvard. [5]Este avance hizo que la técnica fuera más compatible con los microscopios de escaneo láser modernos . [6] Desde entonces, la popularidad de CRS en la investigación biomédica comenzó a crecer. El CRS se utiliza principalmente para obtener imágenes de lípidos, proteínas y otras biomoléculas en células o tejidos vivos o fijados sin marcaje ni tinción . [7] CRS también se puede utilizar para obtener imágenes de muestras etiquetadas con etiquetas Raman, [8] [9] [10] que pueden evitar la interferencia de otras moléculas y normalmente permiten señales de CRS más fuertes que las que normalmente se obtendrían para biomoléculas comunes. CRS también encuentra aplicación en otros campos, como la ciencia de los materiales [11] y la ciencia ambiental. [12]
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Fondo
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La dispersión Raman coherente se basa en la dispersión Raman (o dispersión Raman espontánea). En Raman espontáneo, solo se utiliza un láser de excitación monocromático. La intensidad de la señal de la dispersión Raman espontánea crece linealmente con la potencia promedio de un láser de bomba de onda continua . En CRS, [7] se utilizan dos láseres para excitar modos vibratorios específicos de las moléculas que se van a captar. El láser con una energía de fotón más alta se denomina normalmente láser de bombeo y el láser con una energía de fotón más baja se llama láser de Stokes. Para producir una señal, sus diferencias de energía fotónica deben coincidir con la energía de un modo vibratorio:
,
donde el .
CRS es un proceso óptico no lineal , donde el nivel de la señal es normalmente una función del producto de las potencias de la bomba y los láseres de Stokes. Por lo tanto, la mayoría de los experimentos de microscopía de CRS se realizan con láseres pulsados , donde una mayor potencia pico mejoró significativamente los niveles de señal de CRS. [13]
Microscopía coherente de dispersión Raman anti-Stokes (CARS)
En CARS, los fotones anti-Stokes (de mayor energía, longitud de onda más corta que la bomba) se detectan como señales.
En la microscopía CARS, normalmente hay dos formas de detectar los fotones recién generados. Uno se llama CARS detectados hacia adelante y el otro CARS detectados por epi. [14] [15] En los CARS detectados hacia adelante, los fotones CARS generados junto con la bomba y los láseres de Stokes atraviesan la muestra. La bomba y los láseres Stokes están completamente bloqueados por un filtro de muesca de alta densidad óptica (OD) . Los fotones CARS son luego detectados por un tubo fotomultiplicador (PMT) o una cámara CCD . En los CARS detectados por epi, los fotones CARS retrodispersados son redirigidos por un espejo dicroico o un divisor de haz polarizador . Después de que se utilizan filtros de alta densidad óptica para bloquear la bomba retrodispersada y los láseres de Stokes, los fotones recién generados son detectados por un PMT. La intensidad de la señal de CARS tiene la siguiente relación con la bomba y las intensidades del láser de Stokes, el número de moléculas en el foco de los láseres y la susceptibilidad Raman de tercer orden de la molécula: [16]
La relación señal-ruido (SNR), que es una característica más importante en los experimentos de imágenes, depende de la raíz cuadrada del número de fotones CARS generados, que se indica a continuación: [16]
Hay otros procesos ópticos no lineales que también generan fotones en la longitud de onda anti-Stokes. Estas señales se denominan normalmente fondo no resonante (NR) de mezcla de cuatro ondas (FWM) en microscopía CARS. Estos antecedentes pueden interferir con la señal CARS de forma constructiva o destructiva. [17] Sin embargo, el problema se puede eludir parcialmente restando las imágenes de resonancia activa y desactivada [18] [19] o utilizando métodos matemáticos para recuperar las imágenes libres de fondo. [20]
Microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS)
En SRS, la intensidad de la transferencia de energía desde la longitud de onda de la bomba a la longitud de onda del láser de Stokes se mide como una señal. Hay dos formas de medir las señales SRS, una es medir el aumento de potencia en el láser de Stokes, que se denomina ganancia Raman estimulada (SRG). El otro es medir la disminución de potencia en el láser de bombeo, lo que se denomina pérdida Raman estimulada (SRL). Dado que el cambio de potencia es del orden de 10 −3 a 10 −6 en comparación con la potencia original de la bomba y los láseres de Stokes, normalmente se emplea un esquema de transferencia de modulación [21] para extraer las señales SRS. [22] La señal SRS depende de la bomba y de la potencia del láser de Stokes de la siguiente manera:
La detección limitada de ruido de disparo se puede lograr si el ruido electrónico de los detectores se reduce muy por debajo del ruido óptico y los láseres tienen ruido de disparo limitado a la frecuencia de detección (frecuencia de modulación). En el caso de ruido de disparo limitado, la relación señal / ruido (SNR) de SRS [16] es
La señal de SRS está libre del fondo no resonante que afecta a la microscopía CARS, aunque puede existir un fondo no resonante mucho más pequeño de otros procesos ópticos (por ejemplo , modulación de fase cruzada , absorción de fotones multicolores ).
El SRS se puede detectar tanto en la dirección de avance como en la dirección epi. En SRS de detección directa, el láser modulado es bloqueado por un filtro de muesca de OD alto y el otro láser se mide mediante un fotodiodo. La modulación transferida del láser modulado al láser no modulado originalmente se extrae normalmente mediante un amplificador de bloqueo de la salida del fotodiodo. En SRS detectado por epi, normalmente hay dos métodos para detectar la señal SRS. Un método consiste en detectar la luz retrodifundida frente al objetivo mediante un fotodiodo con un orificio en el centro. El otro método es similar a la microscopía CARS detectada por epi, donde la luz retrodifundida atraviesa el objetivo y se desvía hacia el lado del camino de la luz, normalmente con la combinación de un divisor de haz polarizador y un cuarto de placa de onda. El láser de Stokes (o la bomba) se detecta después de filtrar la bomba (o el láser de Stokes).
Microscopía CRS bicolor, multicolor e hiperespectral
Un par de longitudes de onda láser solo da acceso a una única frecuencia vibratoria. La obtención de imágenes de muestras en diferentes números de onda puede proporcionar un mapeo químico más específico y cuantitativo de la muestra. [23] [24] [25] [26] [27] [28] Esto se puede lograr mediante imágenes en diferentes números de onda uno tras otro. Esta operación siempre implica algún tipo de sintonía: sintonización de una de las longitudes de onda de los láseres, sintonización de un dispositivo de filtrado espectral o sintonización del retardo de tiempo entre la bomba y los láseres de Stokes en el caso de CRS de enfoque espectral. Otra forma de realizar CRS multicolor es utilizar un láser de picosegundo con un ancho de banda espectral estrecho (<1 nm) como bomba o Stokes y el otro láser con un ancho de banda espectral amplio. En este caso, el espectro del láser de banda ancha transmitido puede extenderse mediante una rejilla y medirse mediante una serie de detectores.
CRS de enfoque espectral
Los CRS normalmente utilizan láseres con láseres de ancho de banda estrecho, cuyo ancho de banda <1 nm, para mantener una buena resolución espectral ~ 15 cm −1 . Los láseres con un ancho de banda inferior a 1 nm son láseres de picosegundos. En CRS-centrándose espectrales, bomba de femtosegundo y láseres de Stokes son igualmente linealmente piaban en láseres de picosegundos. [29] [30] [31] El ancho de banda efectivo se reduce y, por lo tanto, se puede lograr una alta resolución espectral de esta manera con láseres de femtosegundos que normalmente tienen un ancho de banda amplio. El ajuste del número de onda del CRS de enfoque espectral se puede lograr tanto cambiando la longitud de onda central de los láseres como cambiando el retardo entre la bomba y los láseres de Stokes.
Aplicaciones
Histología Raman coherente
Una de las principales aplicaciones de CRS es la histología sin etiquetas, que también se denomina histología Raman coherente o, a veces, histología Raman estimulada. [32] [33] [34] [35] En CRH, las imágenes de CRS se obtienen en imágenes de lípidos y proteínas y, después de algún procesamiento de imágenes, se puede obtener una imagen similar a la tinción H&E . A diferencia de la tinción H&E, la CRH se puede realizar en tejido vivo y fresco y no necesita fijación ni tinción.
Metabolismo celular
El metabolismo de moléculas pequeñas como glucosa, [36] colesterol [37] y fármacos [38] se estudia con CRS en células vivas. Los CRS proporcionan una forma de medir la distribución molecular y las cantidades con un rendimiento relativamente alto.
Imágenes de mielina
La mielina es rica en lípidos. El CRS se utiliza habitualmente para obtener imágenes de mielina en tejidos vivos o fijos para estudiar enfermedades neurodegenerativas u otros trastornos neurales. [39] [40] [41]
Investigación farmacéutica
CRS también puede estudiar las funciones de las drogas. Por ejemplo, un fármaco antileucémico imatinib se estudia con SRS en líneas celulares de leucemia. [38] El estudio reveló el posible mecanismo de su metabolismo en las células y proporcionó información sobre las formas de mejorar la eficacia de los fármacos.
Etiquetas Raman
Aunque CRS permite imágenes sin etiquetas, las etiquetas Raman también se pueden usar para aumentar la señal para objetivos específicos. [42] [9] [8] Por ejemplo, las moléculas deuteradas se utilizan para cambiar la señal Raman a una banda donde la interferencia de otras moléculas está ausente. Las moléculas especialmente diseñadas que contienen isótopos se pueden utilizar como etiquetas Raman para lograr imágenes multicolores de supermultiplexación con SRS. [10]
Comparación con la microscopía confocal Raman
La microscopía confocal Raman normalmente utiliza láseres de onda continua para proporcionar un espectro Raman espontáneo en un amplio rango de números de onda para cada punto de una imagen. Se necesita mucho tiempo para escanear toda la muestra, ya que cada píxel requiere segundos para la adquisición de datos. Todo el proceso de obtención de imágenes es largo y, por lo tanto, es más adecuado para muestras que no se mueven. CRS, por otro lado, mide señales en un solo número de onda, pero permite un escaneo rápido. Si se necesita más información espectral, se puede utilizar CRS multicolor o hiperespectral y la velocidad de escaneo o la calidad de los datos se verán comprometidas en consecuencia. [43]
Comparación entre SRS y CARS
En microscopía CRS, podemos considerar SRS y CARS como dos aspectos del mismo proceso. La señal CARS siempre se mezcla con un fondo de mezcla de cuatro ondas no resonante y tiene una dependencia cuadrática de la concentración de los productos químicos que se obtienen en la imagen. El SRS tiene un fondo mucho más pequeño y depende linealmente de la concentración de la sustancia química que se está fotografiando. Por lo tanto, SRS es más adecuado para imágenes cuantitativas que CARS. En el lado del instrumento, SRS requiere modulación y demodulación (por ejemplo, amplificador de bloqueo o detector resonante). Para imágenes multicanal, SRS requiere demodulación multicanal, mientras que CARS solo necesita una matriz PMT o un CCD. Por lo tanto, la instrumentación requerida es más complicada para SRS que para CARS. [dieciséis]
En el lado de la sensibilidad, SRS y CARS normalmente proporcionan sensibilidades similares. [44] Sus diferencias se deben principalmente a los métodos de detección. En microscopía CARS, PMT, APD o CCD se utilizan como detectores para detectar fotones generados en el proceso CARS. Los PMT se utilizan con mayor frecuencia debido a su gran área de detección y su alta velocidad. En microscopía SRS, los fotodiodos se utilizan normalmente para medir las intensidades del rayo láser. Debido a tales diferencias, las aplicaciones de CARS y SRS también son diferentes. [dieciséis]
Los PMT normalmente tienen una eficiencia cuántica relativamente baja en comparación con los fotodiodos. Esto afectará negativamente a la SNR de la microscopía CARS. Los PMT también tienen una sensibilidad reducida para láseres con longitudes de onda superiores a 650 nm. Por lo tanto, con el sistema láser comúnmente usado para CRS ( láser Ti-zafiro ), CARS se usa principalmente para obtener imágenes en una región de alto número de onda (2800-3400 cm -1 ). La SNR de la microscopía CARS es normalmente deficiente para la obtención de imágenes de huellas dactilares (400–1800 cm −1 ). [dieciséis]
La microscopía SRS utiliza principalmente fotodiodos de silicio como detectores. Los fotodiodos de Si tienen una eficiencia cuántica mucho mayor que los PMT, que es una de las razones por las que la SNR de SRS puede ser mejor que la de CARS en muchos casos. Los fotodiodos de Si también sufren una sensibilidad reducida cuando la longitud de onda del láser es superior a 850 nm. Sin embargo, la sensibilidad sigue siendo relativamente alta y permite la obtención de imágenes en la región de huellas dactilares (400-1800 cm -1 ). [dieciséis]
Ver también
- Espectroscopía coherente anti-Stokes Raman (CARS)
- Óptica no lineal
- Microscopio raman
- Espectroscopía Raman
- Dispersión
- Espectroscopia Raman estimulada
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