La extracción diferencial (también conocida como lisis diferencial) se refiere al proceso mediante el cual se puede extraer el ADN de dos tipos diferentes de células sin mezclar su contenido. La aplicación más común de este método es la extracción de ADN de células epiteliales vaginales y espermatozoides de casos de agresión sexual para determinar los perfiles de ADN de la víctima y el agresor. Su éxito se basa en el hecho de que los espermatozoides empaquetan su ADN utilizando protaminas (en lugar de histonas) que se mantienen unidas por enlaces disulfuro. Las protaminas secuestran el ADN de los espermatozoides, lo que lo hace más resistente a la extracción de ADN que el ADN de las células epiteliales.
Después de determinar que los espermatozoides están presentes (generalmente mediante tinción y microscopía óptica) en una muestra vaginal / rectal, las células epiteliales del sujeto se lisan mediante un método de extracción de ADN estándar, como una extracción con fenol / cloroformo y su ADN se extrae por medios normales. El ADN epitelial en solución se elimina y se guarda, mientras que el ADN del espermatozoide se precipita con las protaminas adheridas. La extracción diferencial utiliza una sustancia química llamada ditiotreitol (DTT) para romper los enlaces de azufre en las protaminas con el fin de liberar su ADN. Una vez que el ADN se separa de las protaminas, es propenso a los métodos de extracción de ADN estándar. Esto crea dos fracciones de ADN diferentes a partir de una muestra, con suerte la de la víctima y la del perpetrador.
Sin embargo, el método descrito es difícil de llevar a cabo porque requiere mucho trabajo y mucho tiempo, lo que conduce a una acumulación de kits de violación no probados. Se estima que solo en los EE. UU. 500.000 kits de violación. [1] Greenspoon y col. [2] informó mejoras en la eficiencia y el rendimiento del procesamiento de muestras mediante la automatización robótica. Sin embargo, los costos asociados para la implementación junto con cantidades de muestras de bajo rendimiento pueden ser poco prácticos para los laboratorios forenses y no pueden justificarse. [3]
Recientemente , se introdujo un procedimiento de extracción de ácido nucleico de varios pasos para proporcionar lisados de ADN de la más alta calidad. [4] Una membrana autosellante permite una liberación y separación gradual del ADN de las muestras mezcladas. Implementado en un sistema de columna giratoria , es ideal para procedimientos de extracción de ADN que involucran la extracción diferencial de muestras forenses como epitelio, saliva o sangre frente a espermatozoides. Los protocolos de extracción simples y confiables tanto para las muestras teñidas como para los hisopos ginecológicos, respectivamente, superan las dificultades a menudo reclamadas en la extracción diferencial (por ejemplo, pérdida de un sedimento de esperma a través de varios pasos de lavado).
Además, una decisión calificada temprana si el proceso de extracción diferencial vale el tiempo y los esfuerzos es posible debido a la separación gradual del búfer. Como prueba previa inmunológica para el semen en una muestra de agresión sexual se puede realizar utilizando la muestra idéntica.
Flujo de trabajo
En primer lugar, las proteínas humanas, por ejemplo, el antígeno de semenogelina humana, pueden aislarse y analizarse inmunológicamente de forma opcional para comprobar rápidamente la presencia de líquido seminal humano. Si esta prueba arroja un resultado positivo, la misma muestra de caso se procesará más. [5] La primera parte de la lisis diferencial se lleva a cabo en condiciones suaves para obtener el ADN femenino. El lisado de las células epiteliales se retiene dentro de la columna incluso durante la incubación con calor y la agitación moderada. Tras la centrifugación, la solución pasa la columna al tubo de recogida. El lisado de ADN se purifica más y se usa para generar un perfil de STR autosómico de la víctima. Para obtener aún más el ADN masculino que identificará al perpetrador, se aplicarán posteriormente condiciones de lisis más duras a la misma columna de filtro sin la necesidad de transportar la muestra para romper los espermatozoides retenidos. Debido al alto rendimiento de ADN, la posibilidad de un perfil de ADN exitoso mediante el análisis posterior aumenta significativamente. Este manejo simple permite ahorrar tiempo y un mayor rendimiento en este proceso manual para mejorar las tasas de solución de delitos y acelerar el análisis de muestras de delitos atrasados.
Referencias
- ^ Horsman KM, Barker SLR, Ferrance JP, Forrest KA, Koen KA, Landers JP. Separación de espermatozoides y células epiteliales en un dispositivo microfabricado: aplicación potencial al análisis forense de la evidencia de agresión sexual. Anal. Chem. 77, 742 749 (2005).
- ^ Greenspoon SA, Ban JD, Sykes K, Ballard EJ, Edler SS, Baisden M, Covington BL. Aplicación de la estación de trabajo de automatización de laboratorio BioMek 2000 y el sistema DNA IQ a la extracción de muestras de casos forenses. J. Forensic Sci. 49, 29 - 39 (2004).
- ^ Voorhees JC, Ferrance JP, Landers JP. Elución mejorada de esperma de hisopos de algodón mediante digestión enzimática para el análisis del kit de violación. J. Foren. Sci. 51, 574 - 579 (2006).
- ^ Nature Methods " Lisis diferencial en un proceso de extracción de un solo tubo para un perfil forense preciso ", 8 de mayo de 2012
- ^ Procedimiento operativo estándar de la extracción diferencial utilizando un enfoque de tubo único