Espectroscopia de fluorescencia
La espectroscopia de fluorescencia (también conocida como fluorimetría o espectrofluorometría ) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Implica el uso de un haz de luz, generalmente luz ultravioleta , que excita los electrones en las moléculas de ciertos compuestos y hace que emitan luz; típicamente, pero no necesariamente, luz visible . Una técnica complementaria es la espectroscopia de absorción . En el caso especial de la espectroscopia de fluorescencia de molécula única, las fluctuaciones de intensidad de la luz emitida se miden a partir de fluoróforos individuales o pares de fluoróforos.
Las moléculas tienen varios estados denominados niveles de energía . La espectroscopia de fluorescencia se ocupa principalmente de los estados electrónicos y vibracionales. Generalmente, la especie que se examina tiene un estado electrónico fundamental (un estado de baja energía) de interés y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay varios estados vibratorios. [1]
En la fluorescencia, la especie se excita primero, absorbiendo un fotón , desde su estado electrónico fundamental a uno de los diversos estados vibratorios en el estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas hacen que la molécula excitada pierda energía vibratoria hasta que alcanza el estado vibratorio más bajo del estado electrónico excitado. Este proceso a menudo se visualiza con un diagrama de Jablonski . [1]
La molécula luego desciende a uno de los varios niveles vibratorios del estado electrónico fundamental nuevamente, emitiendo un fotón en el proceso. [1] Como las moléculas pueden descender a cualquiera de varios niveles vibratorios en el estado fundamental, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Por tanto, analizando las diferentes frecuencias de luz emitida en espectroscopia fluorescente, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles vibracionales.
Para las especies atómicas, el proceso es similar; sin embargo, dado que las especies atómicas no tienen niveles de energía vibratoria, los fotones emitidos suelen tener la misma longitud de onda que la radiación incidente. Este proceso de reemitir el fotón absorbido es "fluorescencia de resonancia" y, si bien es característico de la fluorescencia atómica, también se observa en la fluorescencia molecular. [2]
En una medición de fluorescencia (emisión) típica, la longitud de onda de excitación es fija y la longitud de onda de detección varía, mientras que en una medición de excitación de fluorescencia la longitud de onda de detección es fija y la longitud de onda de excitación varía en una región de interés. Un mapa de emisión se mide registrando los espectros de emisión resultantes de un rango de longitudes de onda de excitación y combinándolos todos juntos. Se trata de un conjunto de datos de superficie tridimensional: intensidad de emisión en función de las longitudes de onda de excitación y emisión, y normalmente se representa como un mapa de contorno.
