microscopio 4Pi
Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . Con él, el rango típico de resolución axial de 500 a 700 nm se puede mejorar a 100 a 150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con 5 a 7 veces menos volumen que el de la microscopía confocal estándar . [1]
La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes de objetivo opuestos, ambos enfocados en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del camino óptico a través de cada una de las dos lentes del objetivo se alinea cuidadosamente para que sea mínima. Mediante este método, las moléculas que residen en el área focal común de ambos objetivos pueden iluminarse coherentemente desde ambos lados y la luz reflejada o emitida también puede recogerse coherentemente, es decir, es posible la superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido que se utiliza para iluminación y detección aumenta y se acerca a su máximo. En este caso, la muestra se ilumina y se detecta desde todos los lados simultáneamente.
El modo de operación de un microscopio 4Pi se muestra en la figura. La luz del láser es dividida por un divisor de haz y dirigida por espejos hacia las dos lentes objetivas opuestas. En el punto focal común se produce la superposición de ambos haces de luz enfocados. Las moléculas excitadas en esta posición emiten luz fluorescente, que es captada por ambas lentes del objetivo, combinada por el mismo divisor de haz y desviada por un espejo dicroico hacia un detector. Allí, la superposición de ambas vías de luz emitidas puede volver a tener lugar.
En el caso ideal, cada lente del objetivo puede captar la luz desde un ángulo sólido de . Con dos lentes de objetivo se puede recolectar desde todas las direcciones (ángulo sólido ). El nombre de este tipo de microscopía se deriva del ángulo sólido máximo posible para excitación y detección. En la práctica, solo se pueden lograr ángulos de apertura de aproximadamente 140° para una lente de objetivo, lo que corresponde a .
El microscopio se puede operar de tres maneras diferentes: En un microscopio 4Pi de tipo A, la superposición coherente de la luz de excitación se usa para generar una resolución aumentada. La luz de emisión se detecta desde un solo lado o en una superposición incoherente desde ambos lados. En un microscopio 4Pi de tipo B, solo interfiere la luz de emisión. Cuando se opera en el modo tipo C, tanto la luz de excitación como la de emisión pueden interferir, lo que lleva al aumento de resolución más alto posible (~7 veces a lo largo del eje óptico en comparación con la microscopía confocal).
En un microscopio 4Pi real, la luz no se puede aplicar o recolectar de todas las direcciones por igual, lo que lleva a los llamados lóbulos laterales en la función de dispersión de puntos . Por lo general (pero no siempre) , la microscopía de excitación de dos fotones se usa en un microscopio 4Pi en combinación con un orificio de emisión para reducir estos lóbulos laterales a un nivel tolerable.
