La microscopía de interferencia clásica , también llamada microscopía de interferencia cuantitativa , utiliza dos haces de luz separados con una separación lateral mucho mayor que la que se usa en la microscopía de contraste de fase o en la microscopía de interferencia diferencial (DIC).
En variantes del microscopio de interferencia donde el objeto y el haz de referencia pasan a través del mismo objetivo, se producen dos imágenes de cada objeto (una es la "imagen fantasma"). Las dos imágenes están separadas lateralmente dentro del campo visual o en diferentes planos focales, según lo determinen los principios ópticos empleados. Estas dos imágenes pueden ser una molestia cuando se superponen, ya que pueden afectar gravemente la precisión de las mediciones de espesor de masa. Por tanto, la rotación de la preparación puede ser necesaria, como en el caso de DIC.
Uno de los primeros microscopios de interferencia utilizables fue diseñado por Dyson [1] y fabricado por Cooke, Troughton & Simms (más tarde Vickers Instruments), York, Inglaterra. Este ingenioso sistema óptico logró imágenes de interferencia sin necesidad de elementos polarizadores en la trayectoria del haz.
Smith [2] [3] diseñó un diseño popular posterior que incluía elementos polarizadores y lo comercializó primero C. Baker, Londres, y posteriormente la American Optical Company en los Estados Unidos.
El problema de la doble imagen que se encuentra comúnmente con todos los diseños mencionados anteriormente se evitó por completo en el diseño del interferómetro Mach-Zehnder implementado por Horn, un instrumento muy costoso que no emplea luz polarizada, pero que requiere objetivos y condensadores duplicados con precisión coincidente. Con este diseño (comercializado por E. Leitz) se logró una separación del haz de 60 mm en microscopía, pero aquí ha surgido la nueva dificultad de equilibrar los espesores ópticos de dos preparaciones de portaobjetos de microscopio separadas (muestra y ficticia) y mantener este equilibrio crítico durante observaciones más largas (p. Ej. estudios de lapso de tiempo de células vivas mantenidas a 37 ° C); de lo contrario, se produce un cambio gradual en el color de interferencia de fondo con el tiempo.
La principal ventaja que ofrecen las mediciones de microscopía de interferencia es la posibilidad de medir la masa seca proyectada de células vivas, que fue explotada por primera vez de manera efectiva por Andrew Huxley en estudios de la estructura y función de las células del músculo estriado, lo que llevó al modelo de filamento deslizante de la contracción muscular. [4]
La microscopía de interferencia se hizo relativamente popular en las décadas de 1940-1970, pero cayó en desuso debido a la complejidad del instrumento y las dificultades tanto en su uso como en la interpretación de los datos de imágenes. En los últimos años, sin embargo, el microscopio de interferencia clásico (en particular el instrumento Mach-Zehnder) ha sido "redescubierto" por los biólogos porque su principal desventaja original (interpretación difícil de las bandas de interferencia traducidas o imágenes complejas en color) ahora puede superarse fácilmente con de grabación de imágenes con cámaras digitales, seguido de la aplicación de algoritmos informáticos que entregan rápidamente los datos procesados como imágenes en falso color de masa seca proyectada. Ejemplos de desarrollos asistidos por computadora de la técnica se encuentran en la aplicación de "DRIMAPS" del laboratorio de Graham Dunn [5] y otros desarrollos recientes de la metodología son descritos por Mahlmann et al. [6] [7] La microscopía de interferencia para inspección industrial, inspección de semiconductores y análisis de estructuras de superficie está muy desarrollada y se utiliza ampliamente. [8]
Historia de la instrumentación y nombres de los fabricantes
- Sistema Smith (C. Baker, Londres, Inglaterra)
- Dyson (Cooke Troughton & Simms, York, Inglaterra)
- Jamin-Lebedeff (E. Leitz, Wetzlar y Zeiss, Alemania)
- Mach – Zehnder (E. Leitz, Wetzlar, Alemania)
Referencias
- ^ Dyson J. (1950). "Un microscopio de interferómetro". Proceedings of the Royal Society A . 204 (1077): 170–187. doi : 10.1098 / rspa.1950.0167 .
- ^ Smith FH (1954). "Dos dispositivos de media sombra para instrumentos de polarización óptica". Naturaleza . 173 (4399): 362–363. doi : 10.1038 / 173362b0 .
- ^ Smith FH (1955). "Interferometría microscópica". Investigación . 8 : 385–395.
- ^ Huxley, AF; Niedergerke, R. (1954). "Cambios estructurales en el músculo durante la contracción; microscopía de interferencia de fibras musculares vivas". Naturaleza . 173 (4412): 971–973. doi : 10.1038 / 173971a0 . PMID 13165697 .
- ^ Zicha, D. Genot, E. Dunn, GA y Kramer, IM (1999). "TGFbeta1 induce un aumento dependiente del ciclo celular en la motilidad de las células epiteliales". Revista de ciencia celular . 112 : 447–454. PMID 9914157 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Mahlmann, DM Jahnke, J. y Loosen, P. (2008). "Determinación rápida del peso seco de células cianobacterianas vivas individuales utilizando el microscopio de interferencia de doble haz Mach-Zehnder". EUR. J. Phycol . 43 : 355–364. doi : 10.1080 / 09670260802168625 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Kaul, RA Mahlmann, DM y Loosen, P. (2010). "La microscopía de interferencia Mach-Zehnder registra ópticamente la actividad celular estimulada eléctricamente en células nerviosas no teñidas". Revista de microscopía . 240 : 60–74. doi : 10.1111 / j.1365-2818.2010.03385.x . PMID 21050214 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ de Groot, P (2015). "Principios de la microscopía de interferencia para la medición de la topografía superficial". Avances en Óptica y Fotónica . 7 : 1–65. doi : 10.1364 / AOP.7.000001 .