Microscopia confocal

La microscopía confocal , con mayor frecuencia microscopía confocal de barrido láser ( CLSM ) o microscopía láser de barrido confocal ( LCSM ), es una técnica de imagen óptica para aumentar la resolución óptica y el contraste de una micrografía mediante el uso de un orificio espacial para bloquear la luz fuera de foco. en la formación de imágenes. [1] La captura de múltiples imágenes bidimensionales a diferentes profundidades en una muestra permite la reconstrucción de estructuras tridimensionales (un proceso conocido como sección óptica) dentro de un objeto. Esta técnica se utiliza ampliamente en las comunidades científica e industrial y las aplicaciones típicas se encuentran en las ciencias de la vida , la inspección de semiconductores y la ciencia de los materiales .

Microscopia confocal
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Principio de funcionamiento de los microscopios de fluorescencia y confocales

La luz viaja a través de la muestra bajo un microscopio convencional tan lejos en la muestra como puede penetrar, mientras que un microscopio confocal solo enfoca un haz de luz más pequeño en un nivel de profundidad estrecho a la vez. El CLSM logra una profundidad de campo controlada y muy limitada.

Principio del sensor de punto confocal de la patente de Minsky
La proteína de fusión GFP se expresa en Nicotiana benthamiana . La fluorescencia es visible por microscopía confocal.

El principio de imagen confocal fue patentado en 1957 por Marvin Minsky [2] y tiene como objetivo superar algunas limitaciones de los microscopios de fluorescencia de campo amplio tradicionales . [3] En un microscopio de fluorescencia convencional (es decir, de campo amplio) , toda la muestra se inunda de manera uniforme con la luz de una fuente de luz. Todas las partes de la muestra se pueden excitar al mismo tiempo y la fluorescencia resultante es detectada por el fotodetector o la cámara del microscopio, incluida una gran parte de fondo desenfocada. Por el contrario, un microscopio confocal utiliza iluminación puntual (consulte Función de dispersión de puntos ) y un orificio en un plano conjugado ópticamente frente al detector para eliminar la señal desenfocada; el nombre "confocal" proviene de esta configuración. Como solo se puede detectar la luz producida por fluorescencia muy cerca del plano focal , la resolución óptica de la imagen , particularmente en la dirección de profundidad de la muestra, es mucho mejor que la de los microscopios de campo amplio. Sin embargo, como gran parte de la luz de la fluorescencia de la muestra se bloquea en el orificio, este aumento de la resolución se produce a costa de una menor intensidad de la señal, por lo que a menudo se requieren exposiciones prolongadas . Para compensar esta caída en la señal después del orificio , la intensidad de la luz es detectada por un detector sensible, generalmente un tubo fotomultiplicador (PMT) o fotodiodo de avalancha , transformando la señal de luz en una eléctrica. [4]

Como solo se ilumina un punto de la muestra a la vez, la obtención de imágenes en 2D o 3D requiere escanear sobre un raster regular (es decir, un patrón rectangular de líneas de escaneo paralelas) en la muestra. El rayo se escanea a través de la muestra en el plano horizontal utilizando uno o más espejos oscilantes ( servocontrolados ). Este método de escaneo generalmente tiene una baja latencia de reacción y la velocidad de escaneo se puede variar. Los escaneos más lentos proporcionan una mejor relación señal-ruido , lo que resulta en un mejor contraste .

El espesor alcanzable del plano focal se define principalmente por la longitud de onda de la luz utilizada dividida por la apertura numérica de la lente del objetivo , pero también por las propiedades ópticas de la muestra. El corte óptico delgado posible hace que estos tipos de microscopios sean particularmente buenos para la obtención de imágenes 3D y el perfilado de superficies de muestras.

Los cortes sucesivos forman una 'pila z', que se puede procesar para crear una imagen 3D, o se fusiona en una pila 2D (predominantemente se toma la intensidad máxima de píxeles, otros métodos comunes incluyen el uso de la desviación estándar o la suma de la píxeles). [1]

La microscopía confocal proporciona la capacidad para el corte óptico en serie, directo y no invasivo de muestras vivas, gruesas e intactas con un mínimo de preparación de la muestra, así como una mejora marginal en la resolución lateral en comparación con la microscopía de campo amplio. [4] Las muestras biológicas a menudo se tratan con tintes fluorescentes para hacer visibles los objetos seleccionados. Sin embargo, la concentración real de tinte puede ser baja para minimizar la alteración de los sistemas biológicos: algunos instrumentos pueden rastrear moléculas fluorescentes individuales. Además, las técnicas transgénicas pueden crear organismos que produzcan sus propias moléculas quiméricas fluorescentes (como una fusión de GFP, proteína verde fluorescente con la proteína de interés). Los microscopios confocales funcionan según el principio de excitación puntual en la muestra (punto limitado por difracción) y detección puntual de la señal fluorescente resultante. Un orificio en el detector proporciona una barrera física que bloquea la fluorescencia desenfocada. Solo se registra el punto enfocado o central del disco de Airy . El escaneo de trama de la muestra un punto a la vez permite recolectar secciones ópticas delgadas simplemente cambiando el enfoque z. Las imágenes resultantes se pueden apilar para producir una imagen en 3D de la muestra.

Esta imagen confocal, tomada en las instalaciones de microscopía óptica EMBL , muestra un grupo de diatomeas con paredes celulares cian, cloroplastos rojos, ADN azul y membranas y orgánulos verdes.

Hay cuatro tipos de microscopios confocales disponibles comercialmente:

Los microscopios de escaneo láser confocal usan múltiples espejos (típicamente 2 o 3 escaneos lineales a lo largo de los ejes xy y) para escanear el láser a través de la muestra y "descanalizar" la imagen a través de un orificio fijo y un detector.

Los microscopios confocales de disco giratorio ( disco de Nipkow ) utilizan una serie de orificios en movimiento en un disco para escanear puntos de luz. Dado que una serie de orificios explora un área en paralelo, cada orificio se permite flotar sobre un área específica durante más tiempo, reduciendo así la energía de excitación necesaria para iluminar una muestra en comparación con los microscopios de barrido láser. La energía de excitación disminuida reduce la fototoxicidad y el fotoblanqueo de una muestra, convirtiéndola a menudo en el sistema preferido para obtener imágenes de células u organismos vivos.

Los microscopios confocales de microlente mejorado o de doble disco giratorio funcionan bajo los mismos principios que los microscopios confocales de disco giratorio, excepto que se coloca un segundo disco giratorio que contiene microlentes antes del disco giratorio que contiene los poros. Cada estenope tiene una microlente asociada. Las microlentes actúan para capturar una banda ancha de luz y enfocarla en cada orificio, aumentando significativamente la cantidad de luz dirigida a cada orificio y reduciendo la cantidad de luz bloqueada por el disco giratorio. Por lo tanto, los microscopios confocales mejorados con microlente son significativamente más sensibles que los sistemas estándar de disco giratorio. Yokogawa Electric inventó esta tecnología en 1992. [5]

Los microscopios de matriz programable (PAM) utilizan un modulador de luz espacial (SLM) controlado electrónicamente que produce un conjunto de orificios en movimiento. El SLM es un dispositivo que contiene una matriz de píxeles con alguna propiedad ( opacidad , reflectividad o rotación óptica ) de los píxeles individuales que se pueden ajustar electrónicamente. El SLM contiene espejos microelectromecánicos o componentes de cristal líquido . La imagen generalmente se adquiere mediante una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).

Cada una de estas clases de microscopio confocal tiene ventajas y desventajas particulares. La mayoría de los sistemas están optimizados para velocidad de grabación (es decir, captura de video) o alta resolución espacial. Los microscopios de escaneo láser confocal pueden tener una densidad de muestreo programable y resoluciones muy altas, mientras que Nipkow y PAM utilizan una densidad de muestreo fija definida por la resolución de la cámara. Las velocidades de cuadro de imágenes suelen ser más lentas para los sistemas de escaneo láser de un solo punto que los sistemas de disco giratorio o PAM. Los microscopios confocales de disco giratorio comerciales alcanzan velocidades de cuadro de más de 50 por segundo [6] , una característica deseable para observaciones dinámicas como imágenes de células vivas.

En la práctica, Nipkow y PAM permiten múltiples poros que escanean la misma área en paralelo [7] siempre que los poros estén lo suficientemente separados.

El desarrollo de vanguardia de la microscopía de escaneo láser confocal ahora permite obtener imágenes con una velocidad de video mejor que la estándar (60 cuadros por segundo) mediante el uso de múltiples espejos de escaneo microelectromecánicos.

Las imágenes de fluorescencia de rayos X confocales es una técnica más nueva que permite el control de la profundidad, además de la orientación horizontal y vertical, por ejemplo, al analizar capas enterradas en una pintura. [8]

CLSM es una técnica de exploración de imágenes en la que la resolución obtenida se explica mejor comparándola con otra técnica de exploración como la del microscopio electrónico de exploración (SEM). CLSM tiene la ventaja de no requerir que una sonda esté suspendida a nanómetros de la superficie, como en un AFM o STM , por ejemplo, donde la imagen se obtiene escaneando con una punta fina sobre una superficie. La distancia desde la lente del objetivo a la superficie (llamada distancia de trabajo ) es típicamente comparable a la de un microscopio óptico convencional. Varía con el diseño óptico del sistema, pero son típicas distancias de trabajo de cientos de micrómetros a varios milímetros.

En CLSM, una muestra se ilumina mediante una fuente láser puntual, y cada elemento de volumen está asociado con una dispersión discreta o intensidad de fluorescencia. Aquí, el tamaño del volumen de escaneo está determinado por el tamaño del punto (cercano al límite de difracción ) del sistema óptico porque la imagen del láser de escaneo no es un punto infinitamente pequeño sino un patrón de difracción tridimensional. El tamaño de este patrón de difracción y el volumen focal que define está controlado por la apertura numérica de la lente del objetivo del sistema y la longitud de onda del láser utilizado. Esto puede verse como el límite de resolución clásico de los microscopios ópticos convencionales que utilizan iluminación de campo amplio. Sin embargo, con la microscopía confocal incluso es posible mejorar el límite de resolución de las técnicas de iluminación de campo amplio porque la apertura confocal se puede cerrar para eliminar órdenes superiores del patrón de difracción [ cita requerida ] . Por ejemplo, si el diámetro del agujero de alfiler se establece en 1 unidad Airy, entonces solo el primer orden del patrón de difracción pasa a través de la apertura hacia el detector mientras que los órdenes superiores están bloqueados, mejorando así la resolución a costa de una ligera disminución en el brillo. En las observaciones de fluorescencia, el límite de resolución de la microscopía confocal a menudo está limitado por la relación señal / ruido causada por el pequeño número de fotones típicamente disponibles en la microscopía de fluorescencia. Se puede compensar este efecto utilizando fotodetectores más sensibles o aumentando la intensidad de la fuente puntual de láser de iluminación. El aumento de la intensidad del láser de iluminación corre el riesgo de un blanqueo excesivo u otros daños en la muestra de interés, especialmente para experimentos en los que se requiere la comparación del brillo de fluorescencia. Cuando se obtienen imágenes de tejidos que son diferencialmente refractivos, como el mesófilo esponjoso de las hojas de las plantas u otros tejidos que contienen espacio aéreo, las aberraciones esféricas que deterioran la calidad de la imagen confocal suelen ser pronunciadas. Sin embargo, tales aberraciones pueden reducirse significativamente montando muestras en perfluorocarbonos no tóxicos ópticamente transparentes, como la perfluorodecalina , que se infiltra fácilmente en los tejidos y tiene un índice de refracción casi idéntico al del agua. [9]

CLSM se utiliza ampliamente en numerosas disciplinas de las ciencias biológicas , desde la biología celular y la genética hasta la microbiología y la biología del desarrollo . [10] También se utiliza en óptica cuántica y en imágenes y espectroscopía de nanocristales.

Biologia y medicina

Ejemplo de una pila de imágenes de microscopio confocal que muestra la distribución de filamentos de actina en una célula.

Clínicamente, CLSM se utiliza en la evaluación de diversas enfermedades oculares y es particularmente útil para la formación de imágenes, el análisis cualitativo y la cuantificación de células endoteliales de la córnea . [11] Se utiliza para localizar e identificar la presencia de elementos fúngicos filamentosos en el estroma corneal en casos de queratomicosis , lo que permite un diagnóstico rápido y, por lo tanto, la institución temprana de la terapia definitiva. La investigación sobre las técnicas CLSM para procedimientos endoscópicos ( endomicroscopía ) también es prometedora. [12] En la industria farmacéutica, se recomendó seguir el proceso de fabricación de formas farmacéuticas de película delgada, para controlar la calidad y uniformidad de la distribución de medicamentos. [13] La microscopía confocal también se utiliza para estudiar biopelículas , estructuras porosas complejas que son el hábitat preferido de los microorganismos. Algunas de las funciones temporales y espaciales de las biopelículas solo pueden entenderse mediante el estudio de su estructura en micro y mesoescalas. El estudio de la microescala es necesario para detectar la actividad y organización de microorganismos individuales. [14]

Óptica y cristalografía

CLSM se utiliza como mecanismo de recuperación de datos en algunos sistemas de almacenamiento de datos ópticos 3D y ha ayudado a determinar la edad del papiro Magdalen .

Preservación de audio

El sistema IRENE utiliza microscopía confocal para escaneo óptico y recuperación de audio histórico dañado. [15]

Mejora de la resolución axial

La función de dispersión de puntos del agujero de alfiler es un elipsoide, varias veces más largo que ancho. Esto limita la resolución axial del microscopio. Una técnica para superar esto es la microscopía 4Pi, en la que se permite que la luz incidente o emitida interfiera tanto desde arriba como desde abajo de la muestra para reducir el volumen del elipsoide. Una técnica alternativa es la microscopía theta confocal . En esta técnica, el cono de luz iluminante y la luz detectada forman un ángulo entre sí (mejores resultados cuando son perpendiculares). La intersección de las funciones de dispersión de dos puntos da un volumen de muestra efectivo mucho menor. A partir de esto se desarrolló el microscopio de iluminación de un solo plano . Además, se puede emplear la deconvolución utilizando una función de dispersión de puntos derivada experimentalmente para eliminar la luz desenfocada, mejorando el contraste en los planos axial y lateral.

Súper resolución

Existen variantes confocales que logran una resolución por debajo del límite de difracción, como la microscopía de reducción de emisión estimulada (STED). Además de esta técnica una amplia variedad de otros (basada no confocal) técnicas de super-resolución están disponibles como PALM, (d) STORM, SIM, y así sucesivamente. Todos tienen sus propias ventajas, como la facilidad de uso, la resolución y la necesidad de equipos especiales, tampones o fluoróforos.

Operabilidad a baja temperatura

Para obtener imágenes de muestras a bajas temperaturas, se han utilizado dos enfoques principales, ambos basados ​​en la arquitectura de microscopía confocal de barrido láser . Un enfoque es utilizar un criostato de flujo continuo : solo la muestra está a baja temperatura y se direcciona ópticamente a través de una ventana transparente. [16] Otro enfoque posible es tener parte de la óptica (especialmente el objetivo del microscopio) en un depósito criogénico dewar . [17] Este segundo enfoque, aunque más engorroso, garantiza una mejor estabilidad mecánica y evita las pérdidas debidas a la ventana.

  • β-tubulina en Tetrahymena (un protozoo ciliado ).

  • Perfil de superficie parcial de una moneda de 1 euro, medido con un microscopio confocal de disco de Nipkow.

  • Datos de reflexión para la moneda de 1 euro.

  • Imagen codificada por colores de los filamentos de actina en una célula cancerosa .

  • Señal verde del anticuerpo anti- tubulina conjugado con Alexa Fluor 488) y núcleos (señal azul del ADN teñido con DAPI) en células de meristemo de raíz Arabidopsis thaliana de 4 días (Col-0). Barra de escala: 5 um.

Los inicios: 1940-1957

Esquema de la solicitud de patente de Minsky que muestra el principio del microscopio de barrido confocal de transmisión que construyó.

En 1940 Hans Goldmann, oftalmólogo en Berna , Suiza, desarrolló un sistema de lámpara de hendidura para documentar los exámenes oculares. [18] Este sistema es considerado por algunos autores posteriores como el primer sistema óptico confocal. [19] [20]

En 1943, Zyun Koana publicó un sistema confocal. [21] [19] Una figura de esta publicación muestra una trayectoria de haz de transmisión confocal.

En 1951, Hiroto Naora, un colega de Koana, describió un microscopio confocal en la revista Science para espectrofotometría . [22]

El primer microscopio de barrido confocal fue construido por Marvin Minsky en 1955 y se presentó una patente en 1957. El barrido del punto de iluminación en el plano focal se logró moviendo la platina. No se envió ninguna publicación científica y no se conservaron imágenes realizadas con ella. [23] [24]

El microscopio de barrido en tándem

Esquema del microscopio de barrido en tándem de Petráň. Se agregó una barra roja para indicar el disco Nipkow.

En la década de 1960, el checoslovaco Mojmír Petráň de la Facultad de Medicina de la Universidad Charles en Plzeň desarrolló el microscopio de barrido en tándem, el primer microscopio confocal comercializado. Fue vendido por una pequeña empresa en Checoslovaquia y en los Estados Unidos por Tracor-Northern (más tarde Noran) y utilizó un disco Nipkow giratorio para generar múltiples poros de excitación y emisión. [20] [25]

La patente checoslovaca fue presentada en 1966 por Petráň y Milan Hadravský, un colaborador checoslovaco. Una primera publicación científica con datos e imágenes generadas con este microscopio fue publicada en la revista Science en 1967, escrita por M. David Egger de la Universidad de Yale y Petráň. [26] Como nota al pie de este artículo se menciona que Petráň diseñó el microscopio y supervisó su construcción y que fue, en parte, un "investigador asociado" en Yale. Una segunda publicación de 1968 describía la teoría y los detalles técnicos del instrumento y tenía a Hadravský y Robert Galambos , el jefe del grupo en Yale, como autores adicionales. [27] En 1970 se concedió la patente estadounidense. Fue archivado en 1967. [28]

1969: El primer microscopio de barrido láser confocal.

En 1969 y 1971, M. David Egger y Paul Davidovits de la Universidad de Yale , publicaron dos artículos que describen el primer microscopio de barrido láser confocal . [29] [30] Era un escáner de puntos, lo que significa que solo se generó un punto de iluminación. Se utilizó microscopía de reflexión epi-iluminación para la observación del tejido nervioso. Un láser de helio-neón de 5 mW con luz de 633 nm fue reflejado por un espejo semitransparente hacia el objetivo. El objetivo era una lente simple con una distancia focal de 8.5 mm. A diferencia de todos los sistemas anteriores y posteriores, la muestra se escaneó mediante el movimiento de esta lente (escaneo objetivo), lo que provocó un movimiento del punto focal. La luz reflejada regresó al espejo semitransparente, la parte transmitida fue enfocada por otra lente en el orificio de detección detrás del cual se colocó un tubo fotomultiplicador. La señal se visualizó mediante un CRT de un osciloscopio, el rayo catódico se movió simultáneamente con el objetivo. Un dispositivo especial permitió hacer fotos Polaroid , tres de las cuales se mostraron en la publicación de 1971.

Los autores especulan sobre tintes fluorescentes para investigaciones in vivo . Citan patente de Minsky, gracias Steve Baer, en el momento en que un estudiante de doctorado en la Escuela de Medicina Albert Einstein en Nueva York , donde desarrolló un microscopio de barrido de línea confocal, [31] por lo que sugiere utilizar un láser con 'microscopio de Minsky' y agradezco a Galambos, Hadravsky y Petráň por las discusiones que llevaron al desarrollo de su microscopio. La motivación para su desarrollo fue que en el microscopio de barrido en tándem solo una fracción de 10 −7 de la luz de iluminación participa en la generación de la imagen en el ocular. Por tanto, la calidad de la imagen no fue suficiente para la mayoría de las investigaciones biológicas. [19] [32]

1977–1985: Escáneres puntuales con láser y escaneo de escenario

En 1977 Colin JR Sheppard y Amarjyoti Choudhury , Oxford , Reino Unido, publicaron un análisis teórico de microscopios confocales y de barrido láser. [33] Es probablemente la primera publicación que utiliza el término "microscopio confocal". [19] [32]

En 1978, los hermanos Christoph Cremer y Thomas Cremer publicaron un diseño para un microscopio de escaneo láser confocal que utiliza excitación fluorescente con enfoque automático electrónico. También sugirieron una iluminación de punto láser mediante el uso de un " holograma de 4π puntos ". [32] [34] Este diseño CLSM combinó el método de escaneo láser con la detección 3D de objetos biológicos etiquetados con marcadores fluorescentes por primera vez.

En 1978 y 1980, el grupo de Oxford alrededor de Colin Sheppard y Tony Wilson describió un microscopio confocal con iluminación epi-láser, escaneo de escenario y tubos fotomultiplicadores como detectores. El escenario podría moverse a lo largo del eje óptico (eje z), permitiendo secciones ópticas en serie. [32]

En 1979, Fred Brakenhoff y sus colaboradores demostraron que las ventajas teóricas del seccionamiento óptico y la mejora de la resolución son realmente alcanzables en la práctica. En 1985 este grupo se convirtió en el primero en publicar imágenes convincentes tomadas con un microscopio confocal que fueron capaces de responder preguntas biológicas. [35] Poco después, muchos más grupos comenzaron a utilizar la microscopía confocal para responder preguntas científicas que hasta entonces habían sido un misterio debido a las limitaciones tecnológicas.

En 1983, IJ Cox y C. Sheppard de Oxford publicaron el primer trabajo en el que un microscopio confocal era controlado por una computadora. Oxford Optoelectronics (después de varias adquisiciones adquiridas por BioRad) ofreció el primer microscopio de barrido láser comercial, el escáner de escenario SOM-25, a partir de 1982. Se basó en el diseño del grupo Oxford. [20] [36]

A partir de 1985: escáneres de punto láser con escaneo de haz

A mediados de la década de 1980, William Bradshaw Amos y John Graham White y sus colegas que trabajaban en el Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge construyeron el primer microscopio de barrido de haz confocal. [37] [38] El escenario con la muestra no se movía, sino el punto de iluminación, lo que permitía una adquisición de imágenes más rápida: cuatro imágenes por segundo con 512 líneas cada una. Imágenes intermedias enormemente ampliadas, debido a una trayectoria de haz de 1-2 metros de largo, permitieron el uso de un diafragma de iris convencional como un "agujero de alfiler", con diámetros de ~ 1 mm. Las primeras micrografías se tomaron con una exposición prolongada en película antes de agregar una cámara digital. Una mejora adicional permitió ampliar la preparación por primera vez. Zeiss , Leitz y Cambridge Instruments no tenían ningún interés en una producción comercial. [39] El Consejo de Investigación Médica (MRC) finalmente patrocinó el desarrollo de un prototipo. El diseño fue adquirido por Bio-Rad , modificado con control por computadora y comercializado como 'MRC 500'. El sucesor MRC 600 fue más tarde la base para el desarrollo del primer microscopio fluorescente de dos fotones desarrollado en 1990 en la Universidad de Cornell . [35]

Los desarrollos en el KTH Royal Institute of Technology en Estocolmo casi al mismo tiempo llevaron a un CLSM comercial distribuido por la empresa sueca Sarastro. [40] La empresa fue adquirida en 1990 por Molecular Dynamics, [41] pero el CLSM finalmente se suspendió. En Alemania, Heidelberg Instruments , fundada en 1984, desarrolló un CLSM, que inicialmente estaba destinado a aplicaciones industriales en lugar de biología. Este instrumento fue adquirido en 1990 por Leica Lasertechnik . Zeiss ya tenía en el mercado un microscopio de escaneo láser de punto volador no confocal que se actualizó a confocal. Un informe de 1990 [42] menciona algunos fabricantes de confocales: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern y Zeiss. [35]

En 1989, Fritz Karl Preikschat , con su hijo Ekhard Preikschat, inventó el microscopio de diodo láser de barrido para el análisis del tamaño de partículas. [43] [44] Él y Ekhard Preikschat cofundaron Lasentec para comercializarlo. En 2001, Mettler Toledo adquirió Lasentec . [45] Se utilizan principalmente en la industria farmacéutica para proporcionar control in situ del proceso de cristalización en grandes sistemas de purificación.

  • Espectroscopia de modulación de carga
  • Deconvolución
  • Microscopio de fluorescencia
  • Haz de iones enfocado
  • Apilamiento de enfoque
  • Microscopía confocal de barrido láser
  • Imágenes de células vivas
  • Lente de objetivo de microscopio
  • Portaobjetos de microscopio
  • Microscopio optico
  • Seccionamiento óptico
  • Fotodetector
  • Función de dispersión de puntos
  • Microscopio de reducción de emisiones estimuladas
  • Microscopía de súper resolución
  • Microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)
  • Microscopía de excitación de dos fotones : aunque utilizan una tecnología relacionada (ambos son microscopios de barrido láser), los microscopios de fluorescencia multifotónicos no son estrictamente confocales. El término confocal surge de la presencia de un diafragma en el plano focal conjugado (confocal). Este diafragma suele estar ausente en los microscopios multifotónicos.

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  • CLSM virtual (basado en Java)
  • Animaciones y explicaciones sobre varios tipos de microscopios, incluidos microscopios fluorescentes y confocales (Université Paris Sud)