El seccionamiento óptico es el proceso mediante el cual un microscopio diseñado adecuadamente puede producir imágenes claras de planos focales en lo profundo de una muestra gruesa. Esto se utiliza para reducir la necesidad de realizar cortes finos con instrumentos como el micrótomo . Se utilizan muchas técnicas diferentes para el corte óptico y varias técnicas de microscopía están diseñadas específicamente para mejorar la calidad del corte óptico.
Un buen corte óptico, a menudo denominado como buena profundidad o resolución z, es popular en la microscopía moderna, ya que permite la reconstrucción tridimensional de una muestra a partir de imágenes capturadas en diferentes planos focales.
Corte óptico en microscopios ópticos tradicionales [ editar ]
En un microscopio ideal, solo se permitiría que la luz del plano focal llegue al detector (generalmente un observador o un CCD ) produciendo una imagen clara del plano de la muestra en la que se enfoca el microscopio. Desafortunadamente, un microscopio no es tan específico y la luz de fuentes fuera del plano focal también llega al detector; en una muestra gruesa puede haber una cantidad significativa de material, y por tanto una señal falsa, entre el plano focal y la lente del objetivo .
Sin modificaciones en el microscopio, es decir, con un simple microscopio de luz de campo amplio , la calidad del corte óptico se rige por la misma física que el efecto de profundidad de campo en la fotografía . Para una lente de apertura numérica alta , equivalente a una apertura amplia , la profundidad de campo es pequeña ( enfoque poco profundo ) y proporciona un buen corte óptico. Los objetivos de gran aumento suelen tener aperturas numéricas más altas (y, por lo tanto, mejores secciones ópticas) que los objetivos de bajo aumento. Los objetivos de inmersión en aceite suelen tener aberturas numéricas aún más grandes, por lo que se mejora el seccionamiento óptico.
La resolución en la dirección de profundidad (la "resolución z") de un microscopio de campo amplio estándar depende de la apertura numérica y la longitud de onda de la luz y se puede aproximar como:
donde λ es la longitud de onda, n el índice de refracción del medio de inmersión del objetivo y NA la apertura numérica. [2]
En comparación, la resolución lateral se puede aproximar como: [3]
Técnicas para mejorar el corte óptico [ editar ]
Microscopía de luz de campo brillante [ editar ]
Más allá del aumento de la apertura numérica, existen pocas técnicas disponibles para mejorar el corte óptico en microscopía de luz de campo brillante. La mayoría de los microscopios con objetivos de inmersión en aceite están alcanzando los límites de apertura numérica posible debido a los límites de refracción .
El contraste de interferencia diferencial (DIC) proporciona mejoras modestas al seccionamiento óptico. En DIC, la muestra se ilumina eficazmente mediante dos fuentes de luz ligeramente desplazadas que luego interfieren para producir una imagen resultante de las diferencias de fase de las dos fuentes. Como el desplazamiento en las fuentes de luz es pequeño, la única diferencia de fase se debe al material cercano al plano focal.
Microscopía de fluorescencia [ editar ]
En la microscopía de fluorescencia, los objetos fuera del plano focal solo interfieren con la imagen si están iluminados y emiten fluorescencia. Esto agrega una forma adicional en la que se puede mejorar el corte óptico al hacer que la iluminación sea específica solo para el plano focal.
La microscopía confocal utiliza un punto de exploración o puntos de luz para iluminar la muestra. Junto con un orificio en un plano focal conjugado, esto actúa para filtrar la luz de fuentes fuera del plano focal para mejorar el corte óptico. [4]
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ilumina la muestra con luz de excitación en un ángulo de 90 ° con la dirección de observación, es decir, solo se ilumina el plano focal utilizando un láser que solo se enfoca en una dirección (lámina de luz). [5] Este método reduce eficazmente la luz desenfocada y, además, puede conducir a una mejora modesta en la resolución longitudinal, en comparación con la microscopía de fluorescencia epi.
Las técnicas de excitación dual y multifotónica aprovechan el hecho de que los fluoróforos pueden ser excitados no solo por un solo fotón de la energía correcta , sino también por múltiples fotones, que juntos proporcionan la energía correcta. El efecto adicional dependiente de la " concentración " de requerir que múltiples fotones interactúen simultáneamente con un fluoróforo proporciona una estimulación muy cerca del plano focal. Estas técnicas se utilizan normalmente junto con la microscopía confocal. [6]
Se están desarrollando activamente otras mejoras en el seccionamiento óptico, que funcionan principalmente a través de métodos para eludir el límite de difracción de la luz. Los ejemplos incluyen interferometría de fotón único a través de dos lentes de objetivo para brindar información de profundidad extremadamente precisa sobre un solo fluoróforo [7] y microscopía de iluminación estructurada tridimensional . [8]
El corte óptico de microscopios de campo amplio normales se puede mejorar significativamente mediante la deconvolución , una técnica de procesamiento de imágenes para eliminar el desenfoque de la imagen según una función de dispersión de puntos medida o calculada . [9]
Agentes de compensación [ editar ]
El corte óptico se puede mejorar mediante el uso de agentes de limpieza que posean un índice de refracción alto (> 1,4) como el alcohol bencílico / benzoato de bencilo (BABB) o el éter bencílico [10], que hacen que las muestras sean transparentes y, por lo tanto, permiten la observación de las estructuras internas .
Otro [ editar ]
El seccionamiento óptico está poco desarrollado en microscopios sin luz. [ cita requerida ]
Los microscopios de rayos X y electrónicos suelen tener una gran profundidad de campo (corte óptico deficiente) y, por lo tanto, el corte fino de muestras todavía se usa ampliamente.
Aunque una física similar guía el proceso de enfoque, [11] Los microscopios de sonda de barrido y los microscopios de barrido electrónico no se tratan normalmente en el contexto del seccionamiento óptico, ya que estos microscopios solo interactúan con la superficie de la muestra.
La microscopía de reflexión interna total es una técnica de microscopía fluorescente, que restringe intencionalmente la observación a las superficies superior o inferior de una muestra, pero con una resolución de profundidad extremadamente alta.
Se ha demostrado teórica y experimentalmente la obtención de imágenes en 3D utilizando una combinación de sección focal e inclinación para proporcionar una resolución 3D excepcional en grandes campos de visión. [12]
Alternativas [ editar ]
Las principales alternativas al seccionamiento óptico son:
- Corte fino de la muestra, por ejemplo, como se usa en histología .
- Tomografía , que está particularmente bien desarrollada para microscopía electrónica de transmisión .
Referencias [ editar ]
- ^ Qian, Jia; Lei, Ming; Dan, Dan; Yao, Baoli; Zhou, Xing; Yang, Yanlong; Yan, Shaohui; Min, Junwei; Yu, Xianghua (2015). "Microscopía óptica de corte con iluminación estructurada a todo color" . Informes científicos . 5 : 14513. Bibcode : 2015NatSR ... 514513Q . doi : 10.1038 / srep14513 . PMC 4586488 . PMID 26415516 .
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