Las propiedades ópticas de todos los materiales líquidos y sólidos cambian en función de la longitud de onda de la luz utilizada para medirlos. Este cambio en función de la longitud de onda se denomina dispersión de las propiedades ópticas. El gráfico creado al trazar la propiedad óptica de interés por la longitud de onda a la que se mide se llama curva de dispersión.
La tinción de dispersión es una técnica analítica utilizada en microscopía óptica que aprovecha las diferencias en la curva de dispersión del índice de refracción de un material desconocido con respecto a un material estándar con una curva de dispersión conocida para identificar o caracterizar ese material desconocido. Estas diferencias se manifiestan como un color cuando las dos curvas de dispersión se cruzan para alguna longitud de onda visible. Esta es una técnica de tinción óptica y no requiere tintes ni tintes para producir el color. Su uso principal hoy es la confirmación de la presencia de amianto en materiales de construcción [1] [2] [3] pero tiene muchas otras aplicaciones. [4] [5] [6] [7] [8] [9]
Tipos
Hay cinco configuraciones ópticas básicas del microscopio que se utilizan para la tinción por dispersión. Cada configuración tiene sus ventajas y desventajas. Los dos primeros de ellos, tinción de dispersión de línea de Becke y tinción de dispersión oblicua, fueron reportados por primera vez en los Estados Unidos por FE Wright en 1911 basándose en el trabajo realizado por O. Maschke en Alemania durante la década de 1870. [10] Las cinco configuraciones de tinción de dispersión son:
- Tinción por dispersión de líneas de Becke de colores [11] (Maschke, 1872; Wright, 1911)
- Tinción por dispersión de iluminación oblicua (Wright, 1911)
- Tinción por dispersión de campo oscuro [12] (Crossmon, 1948)
- Tinción por dispersión de contraste de fase [13] (Crossmon, 1949)
- Tinción objetiva para detener la dispersión [14] (Cherkasov, 1958)
Todas estas configuraciones tienen los mismos requisitos para la preparación de la muestra a examinar. Primero, la sustancia de interés debe estar en íntimo contacto con el material de referencia conocido. En otras palabras, el sólido limpio debe montarse en un líquido de referencia, una fase mineral debe estar en contacto íntimo con la fase mineral de referencia, o el líquido homogéneo debe contener el sólido de referencia. La mayoría de las aplicaciones involucran un sólido montado en un líquido de referencia (denominado medio de montaje). En segundo lugar, los colores de dispersión solo estarán presentes si los dos materiales tienen el mismo índice de refracción para alguna longitud de onda en el espectro visible (denominado λo) y tienen curvas de dispersión muy diferentes para el índice de refracción. Finalmente, la muestra debe estar debidamente montada debajo de un cubreobjetos para minimizar cualquier otro efecto óptico que pudiera complicar la interpretación del color visto. Una vez que se cumplen estos criterios, la muestra está lista para ser examinada.
La configuración inicial del microscopio para todos estos métodos es la iluminación de Köhler correctamente ajustada . Se requieren algunos ajustes adicionales para cada uno de los métodos.
Tinción de dispersión de línea de Becke
El método Becke 'Line aprovecha el hecho de que las partículas se comportan básicamente como lentes porque tienden a ser más delgadas en los bordes que en el centro. Si la partícula tiene un índice de refracción más alto que el líquido que la rodea, entonces se comporta como una lente convexa y enfoca un haz de luz paralelo en el lado opuesto a la fuente de luz. Mirando a través del microscopio, esto se ve como un anillo de luz brillante, la línea de Becke`, que se mueve desde el borde a medida que la partícula se desenfoca al aumentar la distancia entre la platina del microscopio y el objetivo. Si la platina se acerca al objetivo, la partícula se comporta como una lupa y la imagen de la línea de Becke` se amplía y aparece fuera de la partícula.
Un requisito para este método es que el haz de luz entrante sea lo más paralelo posible. Esto requiere el cierre del iris del condensador de la sub-etapa. Cerrar el iris del condensador de la sub-etapa disminuye la resolución de la partícula y aumenta la profundidad de campo sobre la cual otros objetos pueden interferir con el efecto visto. Para partículas grandes, esto no es una limitación significativa, pero para partículas pequeñas es un problema.
Cuando se cumplen las condiciones para la tinción por dispersión (la partícula está montada en un líquido con un índice de refracción coincidente en el rango visible de longitudes de onda pero con un índice de refracción muy diferente), la partícula tiene un índice de refracción alto en la parte roja del espectro. y un índice de refracción más bajo en azul. Esto se debe a que los líquidos tienden a tener una curva de dispersión más pronunciada que los sólidos incoloros. Como resultado, cuando la partícula se desenfoca, las longitudes de onda rojas se enfocan hacia adentro. Para las longitudes de onda azules, la partícula se comporta como una lente cóncava y la línea azul de Becke` se mueve hacia el líquido.
El color de estas dos bandas de luz variará dependiendo de dónde coincidan la partícula y el líquido en el índice de refracción, la ubicación de λo. Si la coincidencia está cerca del extremo azul del espectro, la línea de Becke que se mueve hacia la partícula contendrá casi todas las longitudes de onda visibles excepto el azul y aparecerá como un amarillo pálido. La línea de Becke` que se mueva aparecerá de un azul muy oscuro. Si la coincidencia está cerca del extremo rojo del espectro, la línea de Becke` que se mueve hacia la partícula aparecerá de color rojo oscuro y la línea de Becke` que se mueva hacia afuera aparecerá en azul pálido. Si el λo está cerca de la mitad de las longitudes de onda visibles, entonces la Línea Becke` que se mueve hacia la partícula será naranja y la Línea Becke` que se mueve hacia afuera será azul cielo. Los colores que se ven (ver Cuadro 1) se pueden utilizar para determinar con mucha precisión el índice de refracción de lo desconocido o confirmar la identidad de lo desconocido, como en el caso de la identificación de amianto. Se pueden ver ejemplos de este tipo de tinción de dispersión y los colores que se muestran para diferentes λo en http://microlabgallery.com/gallery-dsbecke.aspx . La presencia de dos colores ayuda a marcar la longitud de onda a la que coincide el índice de refracción de los dos materiales.
El método de tinción por dispersión de Becke 'Line se utiliza principalmente como técnica exploratoria. A medida que se escanea un campo de partículas y el enfoque fino se ajusta constantemente y se observa un destello de color alrededor o en una partícula, se puede usar uno de los otros métodos para agudizar la sensibilidad al determinar la longitud de onda coincidente. Para partículas grandes (de más de 25 micrómetros de diámetro), las líneas de Becke` coloreadas pueden ser lo suficientemente distintas para determinar el lo con la precisión requerida. Para partículas muy grandes (más de 100 micrómetros), este puede ser el mejor método porque es menos sensible a otros tipos de interferencias ópticas.
Tinción de dispersión de iluminación oblicua
La tinción por dispersión de iluminación oblicua es el resultado de la refracción y la forma convexa de la mayoría de las partículas. Con iluminación oblicua, el haz de luz que ilumina la muestra se dirige en un ángulo oblicuo a través de la muestra. Esto mejora la resolución de los detalles estructurales en la partícula que están orientados en ángulo recto con el haz de luz incidente mientras sacrifica parte de la resolución de las características paralelas a la dirección del haz. Debido a esta orientación del haz, se hace evidente el índice de refracción relativo de la partícula y el líquido de montaje. Las longitudes de onda para las que el líquido tiene el índice de refracción más alto se refractan hacia la lente frontal del objetivo desde el lado de la partícula más cercano al lado de donde proviene la luz. Si la partícula tiene un índice de refracción más alto para todas las longitudes de onda visibles, entonces este lado de la partícula está oscuro. El lado más alejado de la fuente de luz muestra todas las longitudes de onda para las que la partícula tiene el índice de refracción más alto. Estos efectos se ven con la partícula bien enfocada. Esta es una ventaja significativa sobre el método de la línea de Becke porque la partícula no tiene que estar desenfocada para ver los colores y, en general, los colores son más distintos que los colores de dispersión de la línea de Becke. Los colores que se observan con este tipo de tinción de dispersión son aproximadamente los mismos que los del método Becke` Line que se muestran en el Cuadro 1. Se pueden ver ejemplos de este tipo de tinción de dispersión y los colores que se muestran para diferentes λo en el sitio microlabgallery.com para Becke `Tinción por dispersión de líneas . La presencia de dos colores ayuda a marcar la longitud de onda a la que coincide el índice de refracción de los dos materiales.
Tinción de dispersión de iluminación de campo oscuro
La tinción por dispersión de iluminación de campo oscuro es el resultado de que la imagen de la partícula se forma solo por la luz que se refracta, mientras que toda la luz directa que incide en la muestra se orienta en un ángulo tal que no alcanza la lente frontal del objetivo.
El resultado es que el fondo es negro. Todas las características de los objetos en el campo de visión que no coinciden con el índice de refracción del medio de montaje aparecen en blanco brillante. Cuando una partícula se monta en un líquido que coincide con su índice de refracción en algún lugar de las longitudes de onda visibles, esas longitudes de onda no son refractadas por la partícula y no son recogidas por el objetivo. La imagen del objeto está formada por todas las longitudes de onda que quedan. Estas longitudes de onda se combinan para producir un solo color que se puede usar para indicar qué banda de longitudes de onda falta (consulte la Tabla 2). Se pueden ver ejemplos de este tipo de tinción de dispersión y los colores que se muestran para diferentes λo en el sitio microlabgallery.com para Tinción de dispersión de campo oscuro . Este método es más difícil de interpretar debido al color único en lugar de los dos colores entre corchetes, pero es relativamente preciso cerca del centro del rango visible.
Tinción de dispersión de contraste de fase
La tinción por dispersión de contraste de fase requiere que se use un objetivo de contraste de fase con el anillo de fase apropiado en el condensador de la subplaca para ver el efecto. Aprovecha el hecho de que los rayos de luz que no se desplazan de fase por la presencia del objeto se separan de los rayos de fase desplazada en el plano focal posterior del objetivo.
Estos rayos no afectados disminuyen significativamente en intensidad. Con el “Contraste de fase positivo”, la partícula aparece coloreada a partir de las longitudes de onda contribuyentes para las que el medio de montaje tiene el índice de refracción más alto. Debido al tamaño físico de la placa de fase y su imagen en el plano focal posterior del objetivo donde se modifica, se forma un halo alrededor de la partícula. Este halo adquiere el color de las longitudes de onda combinadas para las que la partícula tiene el índice de refracción más alto. Los colores que se ven con este tipo de tinción de dispersión son aproximadamente los mismos que los del método Becke` Line que se muestran en el Cuadro 1. Se pueden ver ejemplos de este tipo de tinción de dispersión y los colores que se muestran para diferentes λo en el sitio microlabgallery.com para Tinción por dispersión de contraste de fase . La presencia de dos colores ayuda a marcar la longitud de onda a la que coincide el índice de refracción de los dos materiales.
Tinción de dispersión de parada objetiva
La tinción de dispersión de parada de objetivo aprovecha el hecho de que toda la luz inalterada por la presencia de partículas en el campo de visión se enfoca en el plano focal posterior del objetivo. Si el iris del condensador de la subplaca está cerrado, toda la luz directa se enfoca en una pequeña imagen de la abertura en el iris del condensador de la subplaca en el plano focal posterior del objetivo. Si se coloca un tope opaco en esa posición, toda la luz directa se bloquea y la imagen de la partícula está formada por las longitudes de onda en las que las partículas y el líquido de montaje no coinciden. Estos colores son básicamente los mismos que los colores que se ven cuando se usa tinción de dispersión de campo oscuro. La doble apertura de este método mejora el efecto de color pero también sacrifica la resolución de las partículas. En campos de visión donde las partículas pueden estar apiladas o muy cerca, puede ser difícil estar seguro de qué partícula pequeña está produciendo realmente el color. Se pueden ver ejemplos de este tipo de tinción de dispersión y los colores que se muestran para diferentes λo en el sitio microlabgallery.com para la tinción de dispersión Objective Stop . Este método es más difícil de interpretar debido al color único en lugar de los dos colores entre corchetes, pero es relativamente preciso cerca del centro del rango visible.
Desarrollo historico
Isaac Newton demostró que la luz "blanca" en realidad estaba compuesta de muchos colores "simples" diferentes y que los materiales tenían propiedades ópticas diferentes dependiendo de cuál de los colores simples se usaba para medirlos. Demostró estos hechos con una serie de experimentos usando uno o más prismas. [15] La diferencia en las propiedades ópticas de los materiales en función de los colores de luz "simples" o monocromáticos se denomina dispersión. También fue la primera persona en notar que diferentes materiales tenían diferentes propiedades de dispersión. Los líquidos "sulfurosos" (líquidos orgánicos) tenían un índice de refracción más alto de lo esperado en base a su gravedad específica y tenían una curva de dispersión más pronunciada que la mayoría de los sólidos. Estas observaciones bien documentadas tardarían poco más de dos siglos en convertirse en una técnica analítica.
El primer documento que documenta los efectos de la dispersión vistos a través del microscopio fue escrito en 1872 por O. Maschke en Alemania. [16] Este documento discutió la aparición de líneas de Becke` coloreadas cuando una partícula estaba en un líquido con índice de refracción coincidente. Antes de este artículo, se pensaba que estos colores eran el resultado de las lentes del microscopio (aberración cromática) y no el resultado del sujeto montado en la diapositiva y el medio en el que estaba montado. En 1884 y 1895 Christian Christiansen publicó sus datos sobre la primera aplicación analítica de colores de dispersión, el filtro Christiansen . Descubrió que al colocar un polvo transparente incoloro en un vial de un líquido orgánico incoloro, podía crear luz monocromática a partir de luz blanca si el líquido y el polvo tuvieran el mismo índice de refracción solo para esa longitud de onda. Solo esa longitud de onda vería un medio ópticamente homogéneo y pasaría directamente a través del vial. Las otras longitudes de onda serían dispersadas en todas direcciones por las partículas en el líquido. La luz monocromática se puede ver mirando a través del vial a lo largo del camino del haz de luz directo. En cualquier otro ángulo se observaría el color complementario de esa longitud de onda. Si eligió un líquido que coincidiera con el índice de refracción del polvo en el rojo lejano, 700 nanómetros de longitud de onda, podría crear cualquier otra longitud de onda calentando el vial, cambiando así la longitud de onda a la que coincidían el índice de refracción del polvo y el líquido. Esta técnica no funcionó con ningún polvo o líquido. Para obtener efectos óptimos, el polvo y el líquido tuvieron que seleccionarse cuidadosamente de modo que la intersección de sus curvas de dispersión creara un ángulo lo más grande posible en todo el rango de longitudes de onda visibles . El interés de Christiansen estaba en la creación de filtros monocromáticos y no en el desarrollo de una técnica analítica. No fue hasta 1911 que FE Wright informó sobre el potencial analítico de los efectos de dispersión. [17] Observó que las líneas coloreadas de Becke` señaladas por Maschke podrían usarse para distinguir entre dos materiales con el mismo índice de refracción pero diferentes curvas de dispersión. Los colores también podrían indicar la región del espectro de luz visible para la cual una partícula y un líquido en el que se montó tenían un índice de refracción coincidente. Wright también señaló que al usar iluminación de transmisión oblicua, la partícula mostraría estos colores sin tener que inspeccionar la línea de Becke.
La literatura técnica tuvo poca discusión adicional sobre los efectos de dispersión hasta 1948. Ese año, SC Crossmon, NB Dodge y los coautores RC Emmons y RN Gates escribieron artículos sobre el uso de efectos de dispersión a través del microscopio para caracterizar partículas. [18] [19] [20] Crossmon parece haber acuñado el término "tinción por dispersión" como cualquier técnica óptica que utiliza el "efecto Christiansen" para producir color en la imagen de partículas incoloras. [21] Demostró el uso de los métodos de tinción por dispersión de contraste de fase, iluminación oblicua, campo oscuro y línea de Becke. SC Crossmon y WC McCrone han publicado numerosos artículos sobre el uso de técnicas de tinción de dispersión de parada de plano focal posterior objetivo desde entonces. Yu. A. Cherkasov publicó un excelente artículo sobre este tema en 1958 y fue traducido al inglés en 1960. [22] Se han escrito más de 100 artículos sobre los diversos métodos de tinción por dispersión y su aplicación desde aproximadamente 1950 y la mayoría de ellos desde 1960 .
A pesar de los primeros trabajos realizados sobre esta técnica, no fue hasta la década de 1950 que se hizo conocida entre los microscopistas. Ahora se reconoce como una herramienta poderosa en la caracterización de materiales y la detección de contaminantes de bajo nivel. Ha demostrado sensibilidad a las partículas contaminantes en polvos hasta partes por millón.
La dispersión del índice de refracción es una propiedad fundamental de la materia. Puede pensarse que es el resultado de la relativa proximidad de las frecuencias armónicas de los electrones de la capa exterior de un compuesto a las frecuencias de la luz visible. La frecuencia armónica del electrón de enlace es el resultado de la energía de ese enlace. Si el enlace es muy fuerte, la frecuencia será muy alta. Cuanto mayor sea la frecuencia, menor será el efecto que tendrá la diferencia de frecuencias del azul al rojo en el índice de refracción. Para los enlaces de energía relativamente alta en la mayoría de los sólidos inorgánicos, esto significa que sus índices de refracción cambian muy poco en el rango visible de frecuencias. Por otro lado, los índices de refracción de los compuestos orgánicos, con sus energías de enlace más bajas, cambian significativamente en el rango visible. Esta diferencia de dispersión es la base del efecto Christiansen y de los métodos de tinción por dispersión.
notas y referencias
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