En clonación molecular y biología , un gen knock-in (abreviatura: KI ) se refiere a un método de ingeniería genética que implica la sustitución uno por uno de la información de la secuencia de ADN en un locus genético o la inserción de información de secuencia que no se encuentra dentro del locus. . [1] Normalmente, esto se hace en ratones, ya que la tecnología para este proceso es más refinada y existe un alto grado de complejidad de secuencia compartida entre ratones y humanos. [2] La diferencia entre la tecnología knock-in y los transgénicos tradicionalestécnicas es que un knock-in involucra un gen insertado en un locus específico y, por lo tanto, es una inserción "dirigida". Es lo opuesto al knockout de genes .
Un uso común de la tecnología knock-in es para la creación de modelos de enfermedades. Es una técnica mediante la cual los investigadores científicos pueden estudiar la función de la maquinaria reguladora (por ejemplo, los promotores ) que gobierna la expresión del gen natural que se reemplaza. Esto se logra observando el nuevo fenotipo del organismo en cuestión. Los BAC y YAC se utilizan en este caso para poder transferir grandes fragmentos.
El knock-in de genes se originó como una ligera modificación de la técnica de knockout original desarrollada por Martin Evans, Oliver Smithies y Mario Capecchi. Tradicionalmente, las técnicas de knock-in se han basado en la recombinación homóloga para impulsar el reemplazo de genes diana, aunque se han desarrollado otros métodos que utilizan un sistema mediado por transposones para insertar el gen diana. [3] El uso de loxPLos sitios flanqueantes que se escinden tras la expresión de Cre recombinasa con vectores génicos es un ejemplo de esto. Las células madre embrionarias con la modificación de interés se implantan luego en un blastocisto viable, que crecerá hasta convertirse en un ratón quimérico maduro, con algunas células que tienen la información genética de las células del blastocisto original y otras células que tienen las modificaciones introducidas en las células madre embrionarias. La descendencia posterior del ratón quimérico tendrá entonces el gen knock-in. [4]
El gen knock-in ha permitido, por primera vez, estudios basados en hipótesis sobre modificaciones genéticas y fenotipos resultantes. Las mutaciones en el gen p53 humano, por ejemplo, pueden inducirse mediante exposición a benzo (a) pireno (BaP) y la copia mutada del gen p53 puede insertarse en genomas de ratón. Los tumores pulmonares observados en los ratones knock-in respaldan la hipótesis de la carcinogenicidad de BaP . [5] Desarrollos más recientes en la técnica de knock-in han permitido que los cerdos tengan un gen para la proteína verde fluorescente insertado con un sistema CRISPR / Cas9 , lo que permite inserciones de genes mucho más precisas y exitosas. [6]La velocidad del gen knock-in mediado por CRISPR / Cas9 también permite que se generen modificaciones bialélicas en algunos genes y que se observe el fenotipo en ratones en una sola generación, un período de tiempo sin precedentes. [7]
La tecnología knock-in es diferente de la tecnología knockout en que la tecnología knockout tiene como objetivo eliminar parte de la secuencia de ADN o insertar información de la secuencia de ADN irrelevante para interrumpir la expresión de un locus genético específico. La tecnología de genes knock-in, por otro lado, altera el locus genético de interés mediante una sustitución uno por uno de la información de la secuencia de ADN o mediante la adición de información de la secuencia que no se encuentra en dicho locus genético. Por lo tanto, un gen knock-in puede verse como una mutación de ganancia de función y un knock-in de gen como una mutación de pérdida de función, pero un knock-in de gen también puede implicar la sustitución de un locus de gen funcional por un fenotipo mutante que resulta en alguna pérdida. de función. [8]