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Este artículo trata sobre el sistema antiviral procariota. Para su uso en la edición de genes, consulte Edición de genes CRISPR .
Cascade (complejo asociado a CRISPR para defensa antiviral)
4QYZ.png
Proteína CRISPR Cascade (cian) unida al ARN CRISPR (verde) y al ADN del fago (rojo) [1]
Identificadores
OrganismoEscherichia coli
SímboloCRISPR
PDB4QYZ
Parte de una serie sobre
Ingeniería genética
Genetic engineering logo.png
 
Organismos genéticamente modificados
Historia y regulación
Proceso
Aplicaciones
Controversias

CRISPR ( / k r ɪ s p ər / ) (que es un acrónimo de agrupadas repeticiones palindrómicas cortas espaciadas regularmente ) es una familia de ADN secuencias encontradas en los genomas de procariotas organismos tales como bacterias y arqueas . [2] Estas secuencias se derivan de fragmentos de ADN de bacteriófagos.que había infectado previamente al procariota. Se utilizan para detectar y destruir el ADN de bacteriófagos similares durante infecciones posteriores. Por tanto, estas secuencias juegan un papel clave en el sistema de defensa antivírico (es decir, anti-fagos) de los procariotas y proporcionan una forma de inmunidad adquirida . [2] [3] [4] [5] CRISPR se encuentran en aproximadamente el 50% de los genomas bacterianos secuenciados y casi el 90% de las arqueas secuenciadas. [6]

Diagrama del mecanismo de defensa antiviral procariota CRISPR [7]

Cas9 (o "proteína 9 asociada a CRISPR") es una enzima que utiliza secuencias CRISPR como guía para reconocer y escindir hebras específicas de ADN que son complementarias a la secuencia CRISPR. Las enzimas Cas9 junto con las secuencias CRISPR forman la base de una tecnología conocida como CRISPR-Cas9 que se puede utilizar para editar genes dentro de organismos. [8] Este proceso de edición tiene una amplia variedad de aplicaciones, incluida la investigación biológica básica, el desarrollo de productos biotecnológicos y el tratamiento de enfermedades. [9] [10] La técnica de edición del genoma CRISPR-Cas9 contribuyó significativamente al premio Nobel de Química en 2020 otorgado a Emmanuelle Charpentiery Jennifer Doudna . [11] [12]

Historia [ editar ]

Secuencias repetidas [ editar ]

El descubrimiento de repeticiones de ADN agrupadas se produjo de forma independiente en tres partes del mundo. La primera descripción de lo que más tarde se llamaría CRISPR es del investigador de la Universidad de Osaka Yoshizumi Ishino y sus colegas en 1987. Clonaron accidentalmente parte de una secuencia CRISPR junto con el gen " iap" (conversión de isoenzimas de fosfatasa alcalina) [13] que estaba su objetivo. La organización de las repeticiones fue inusual. Las secuencias repetidas se organizan típicamente de forma consecutiva, sin secuencias diferentes intercaladas. [13] [10] No conocían la función de las repeticiones agrupadas interrumpidas.

En 1993, investigadores de Mycobacterium tuberculosis en los Países Bajos publicaron dos artículos sobre un grupo de repeticiones directas interrumpidas (RD) en esa bacteria. Reconocieron la diversidad de las secuencias que intervienen en las repeticiones directas entre diferentes cepas de M. tuberculosis [14] y utilizaron esta propiedad para diseñar un método de tipificación que se denominó spoligotyping , que todavía se utiliza en la actualidad. [15] [16]

Francisco Mojica de la Universidad de Alicante en España estudió las repeticiones observadas en los organismos arqueales de las especies Haloferax y Haloarcula , y su función. El supervisor de Mojica supuso en ese momento que las repeticiones agrupadas tenían un papel en la segregación correcta del ADN replicado en las células hijas durante la división celular porque los plásmidos y cromosomas con matrices de repeticiones idénticas no podían coexistir en Haloferax volcanii . También se observó por primera vez la transcripción de las repeticiones interrumpidas; esta fue la primera caracterización completa de CRISPR. [16] [17]Para el año 2000, Mojica realizó una encuesta de literatura científica y uno de sus estudiantes realizó una búsqueda en genomas publicados con un programa ideado por él mismo. Identificaron repeticiones interrumpidas en 20 especies de microbios como pertenecientes a la misma familia. [18] En 2001, Mojica y Ruud Jansen , que buscaban repeticiones interrumpidas adicionales, propusieron el acrónimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para aliviar la confusión derivada de los numerosos acrónimos utilizados para describir las secuencias en la literatura científica. [17] [19] En 2002, Tang, et al. mostró evidencia de que CRISPR repite regiones del genoma de Archaeoglobus fulgidusse transcribieron en moléculas de ARN largas que posteriormente se procesaron en ARN pequeños de longitud unitaria, además de algunas formas más largas de 2, 3 o más unidades espaciadoras-repetidas. [20] [21]

En 2005, el investigador de yogur Rodolphe Barrangou , descubrió que Streptococcus thermophilus , después de desafíos iterativos de fagos, desarrolla una mayor resistencia a los fagos, y esta mayor resistencia se debe a la incorporación de secuencias espaciadoras CRISPR adicionales. [22] La empresa de alimentos danesa Danisco, para la que en ese momento trabajaba Barrangou, desarrolló luego cepas de S. thermophilus resistentes a los fagos para su uso en la producción de yogur. Más tarde, Danisco fue comprada por DuPont , que "posee alrededor del 50 por ciento del mercado mundial de cultivos lácteos" y la tecnología se generalizó. [23]

Sistemas asociados a CRISPR [ editar ]

Una importante adición a la comprensión de CRISPR vino con la observación de Jansen de que el grupo de repeticiones de procariotas estaba acompañado por un conjunto de genes homólogos que componen los sistemas asociados a CRISPR o genes cas . Inicialmente se reconocieron cuatro genes cas ( cas 1-4). Las proteínas Cas mostraron motivos de helicasa y nucleasa , lo que sugiere un papel en la estructura dinámica de los loci CRISPR. [24] En esta publicación se utilizó el acrónimo CRISPR como el nombre universal de este patrón. Sin embargo, la función CRISPR siguió siendo enigmática.

Diagrama simplificado de un locus CRISPR. Se muestran los tres componentes principales de un locus CRISPR: genes cas , una secuencia líder y una matriz de espaciadores repetidos. Las repeticiones se muestran como cuadros grises y los espaciadores son barras de colores. La disposición de los tres componentes no siempre es como se muestra. [25] [26] Además, varios CRISPR con secuencias similares pueden estar presentes en un solo genoma, solo uno de los cuales está asociado con genes cas . [27]

En 2005, tres grupos de investigación independientes demostraron que algunos espaciadores CRISPR se derivan del ADN del fago y del ADN extracromosómico , como los plásmidos . [28] [29] [30] En efecto, los espaciadores son fragmentos de ADN recolectados de virus que previamente intentaron atacar la célula. La fuente de los espaciadores fue una señal de que el sistema CRISPR / cas podría tener un papel en la inmunidad adaptativa en las bacterias . [25] [31] Los tres estudios que proponen esta idea fueron inicialmente rechazados por revistas de alto perfil, pero finalmente aparecieron en otras revistas. [32]

La primera publicación [29] que propone un papel de CRISPR-Cas en la inmunidad microbiana, de Mojica y colaboradores de la Universidad de Alicante , predijo un papel para la transcripción de ARN de los espaciadores en el reconocimiento de blancos en un mecanismo que podría ser análogo a la interferencia del ARN. sistema utilizado por las células eucariotas. Koonin y sus colegas ampliaron esta hipótesis de interferencia de ARN al proponer mecanismos de acción para los diferentes subtipos CRISPR-Cas de acuerdo con la función predicha de sus proteínas. [33]

El trabajo experimental de varios grupos reveló los mecanismos básicos de la inmunidad CRISPR-Cas. En 2007, se publicó la primera evidencia experimental de que CRISPR era un sistema inmunológico adaptativo. [10] [4] Una región CRISPR en Streptococcus thermophilus adquirió espaciadores del ADN de un bacteriófago infectante . Los investigadores manipularon la resistencia de S. thermophilus a diferentes tipos de fagos agregando y eliminando espaciadores cuya secuencia coincidía con las encontradas en los fagos probados. [34] [35] En 2008, Brouns y Van der Oost identificaron un complejo de proteínas Cas (llamado Cascade) que en E. colicortar el precursor de ARN CRISPR dentro de las repeticiones en moléculas de ARN maduras que contienen espaciador llamadas ARN CRISPR (ARNcr), que permaneció unido al complejo proteico. [36] Además, se descubrió que se requería Cascade, crRNA y una helicasa / nucleasa ( Cas3 ) para proporcionar a un huésped bacteriano inmunidad contra la infección por un virus de ADN . Al diseñar un CRISPR antivirus, demostraron que dos orientaciones del crRNA (sentido / antisentido) proporcionaban inmunidad, lo que indica que las guías del crRNA estaban dirigidas al dsDNA. Ese año Marraffini y Sontheimer confirmaron que una secuencia CRISPR de S. epidermidis apuntaba al ADN y no al ARN para evitar la conjugación.. Este hallazgo estaba en desacuerdo con el mecanismo propuesto similar a la interferencia de ARN de la inmunidad CRISPR-Cas, aunque más tarde se encontró un sistema CRISPR-Cas que se dirige al ARN extraño en Pyrococcus furiosus . [10] [34] Un estudio de 2010 mostró que CRISPR-Cas corta ambas cadenas de ADN de fago y plásmido en S. thermophilus . [37]

Cas9 [ editar ]

Artículo principal: Cas9

Los investigadores estudiaron un sistema CRISPR más simple de Streptococcus pyogenes que se basa en la proteína Cas9 . La endonucleasa Cas9 es un sistema de cuatro componentes que incluye dos pequeñas moléculas de crRNA y ARN CRISPR trans-activador (tracrRNA). [38] [39] Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier rediseñaron la endonucleasa Cas9 en un sistema de dos componentes más manejable fusionando las dos moléculas de ARN en un "ARN de guía única" que, cuando se combinaba con Cas9, podía encontrar y cortar el ADN diana especificado por el ARN guía. Esta contribución fue tan significativa que fue reconocida por el Premio Nobel de Química.en 2020. Al manipular la secuencia de nucleótidos del ARN guía, el sistema artificial Cas9 podría programarse para apuntar a cualquier secuencia de ADN para la escisión. [40] Otro grupo de colaboradores que comprende Virginijus Šikšnys junto con Gasiūnas, Barrangou y Horvath mostró que Cas9 del sistema CRISPR de S. thermophilus también se puede reprogramar para apuntar a un sitio de su elección cambiando la secuencia de su crRNA. Estos avances impulsaron los esfuerzos para editar genomas con el sistema CRISPR-Cas9 modificado. [dieciséis]

Los grupos liderados por Feng Zhang y George Church publicaron simultáneamente descripciones de la edición del genoma en cultivos de células humanas utilizando CRISPR-Cas9 por primera vez. [10] [41] [42] Desde entonces se ha utilizado en una amplia gama de organismos, incluida la levadura de panadería ( Saccharomyces cerevisiae ), [43] [44] [45] el patógeno oportunista Candida albicans , [46] [47] pez cebra ( Danio rerio ), [48] moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ), [49] [50] hormigas ( Harpegnathos saltator[51] y Ooceraea biroi [52] ), mosquitos ( Aedes aegypti [53] ), nematodos ( Caenorhabditis elegans ), [54] plantas, [55] ratones, [56] [57] monos [58] y embriones humanos. [59]

CRISPR se ha modificado para producir factores de transcripción programables que permiten a los científicos apuntar y activar o silenciar genes específicos. [60]

El sistema CRISPR-Cas9 ha demostrado realizar ediciones genéticas efectivas en cigotos tripronucleares humanos descritos por primera vez en un artículo de 2015 de los científicos chinos P. Liang e Y. Xu. El sistema realizó una escisión exitosa de la beta-hemoglobina mutante (HBB) en 28 de 54 embriones. 4 de los 28 embriones se recombinaron con éxito utilizando una plantilla de donante proporcionada por los científicos. Los científicos demostraron que durante la recombinación del ADN de la hebra escindida, la secuencia endógena homóloga HBD compite con la plantilla del donante exógeno. La reparación del ADN en embriones humanos es mucho más complicada y particular que en las células madre derivadas. [61]

Cas12a (anteriormente Cpf1) [ editar ]

En 2015, la nucleasa Cas12a (antes conocida como Cpf1 [62] ) se caracterizó en el sistema CRISPR / Cpf1 de la bacteria Francisella novicida . [63] [64] Su nombre original, de una definición de familia de proteínas TIGRFAM construida en 2012, refleja la prevalencia de su subtipo CRISPR-Cas en los linajes Prevotella y Francisella . Cas12a mostró varias diferencias clave de Cas9, que incluyen: causar un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra en lugar del corte 'contundente' producido por Cas9, que se basa en un PAM 'T rico'(que proporciona sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiere solo un ARN CRISPR (crRNA) para una orientación exitosa. Por el contrario, Cas9 requiere tanto crRNA como un crRNA transactivante (tracrRNA).

Estas diferencias pueden darle a Cas12a algunas ventajas sobre Cas9. Por ejemplo, los pequeños crRNA de Cas12a son ideales para la edición del genoma multiplexado, ya que se pueden empaquetar más en un vector que los sgRNA de Cas9. Además, los salientes pegajosos 5 'que deja Cas12a se pueden usar para el ensamblaje de ADN que es mucho más específico de la diana que la clonación tradicional de enzimas de restricción. [65] Por último, Cas12a escinde el ADN de 18 a 23 pares de bases aguas abajo del sitio PAM. Esto significa que no hay interrupción de la secuencia de reconocimiento después de la reparación, por lo que Cas12a permite múltiples rondas de escisión del ADN. Por el contrario, dado que Cas9 corta solo 3 pares de bases aguas arriba del sitio PAM, la vía NHEJ da como resultado indelmutaciones que destruyen la secuencia de reconocimiento, evitando así más rondas de corte. En teoría, las rondas repetidas de escisión del ADN deberían aumentar la oportunidad de que se produzca la edición genómica deseada. [66] Una característica distintiva de Cas12a, en comparación con Cas9, es que después de cortar su objetivo, Cas12a permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssDNA de forma no discriminatoria. [67] Esta propiedad se denomina actividad de "escisión colateral" o "trans-escisión" y se ha aprovechado para el desarrollo de diversas tecnologías de diagnóstico. [68] [69]

Cas13 (anteriormente C2c2) [ editar ]

En 2016 se caracterizó la nucleasa Cas13a (antes conocida como C2c2) de la bacteria Leptotrichia shahii . Cas13 es una endonucleasa de ARN guiada por ARN, lo que significa que no escinde el ADN, sino solo el ARN monocatenario. Cas13 es guiado por su crRNA a un objetivo de ssRNA y se une y escinde el objetivo. De manera similar a Cas12a, el Cas13 permanece unido al objetivo y luego escinde otras moléculas de ssRNA de forma no discriminatoria. [70] Esta propiedad de escisión colateral se ha aprovechado para el desarrollo de diversas tecnologías de diagnóstico. [71] [72] [73]

Estructura del lugar [ editar ]

Repeticiones y espaciadores [ editar ]

La matriz CRISPR se compone de una secuencia líder rica en AT seguida de repeticiones cortas que están separadas por espaciadores únicos. [74] Las repeticiones CRISPR suelen tener un tamaño de 28 a 37 pares de bases (bps), aunque puede haber tan solo 23 pb y hasta 55 pb. [75] Algunos muestran simetría de díadas , lo que implica la formación de una estructura secundaria como un tallo-bucle ('horquilla') en el ARN, mientras que otros están diseñados para no estar estructurados. El tamaño de los espaciadores en diferentes matrices CRISPR es típicamente de 32 a 38 pb (rango de 21 a 72 pb). [75] Pueden aparecer rápidamente nuevos espaciadores como parte de la respuesta inmunitaria a la infección por fagos. [76]Por lo general, hay menos de 50 unidades de la secuencia del espaciador repetido en una matriz CRISPR. [75]

Estructuras de ARN CRISPR [ editar ]

  • CRISPR-DR2
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01315 .
  • CRISPR-DR5
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF011318 .
  • CRISPR-DR6
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01319 .
  • CRISPR-DR8
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01321 .
  • CRISPR-DR9
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01322 .
  • CRISPR-DR19
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01332 .
  • CRISPR-DR41
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01350 .
  • CRISPR-DR52
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01365 .
  • CRISPR-DR57
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01370 .
  • CRISPR-DR65
    Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam . Familia RF01378 .

Genes cas y subtipos CRISPR [ editar ]

Los pequeños grupos de genes cas a menudo se encuentran junto a las matrices de espaciadores de repetición CRISPR. En conjunto, los 93 genes cas se agrupan en 35 familias basándose en la similitud de secuencia de las proteínas codificadas. 11 de las 35 familias forman el núcleo cas , que incluye las familias de proteínas Cas1 a Cas9. Un locus CRISPR-Cas completo tiene al menos un gen que pertenece al núcleo cas . [77]

Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases. Los sistemas de clase 1 utilizan un complejo de múltiples proteínas Cas para degradar los ácidos nucleicos extraños. Los sistemas de clase 2 utilizan una única proteína Cas grande para el mismo propósito. La clase 1 se divide en tipos I, III y IV; la clase 2 se divide en los tipos II, V y VI. [78] Los 6 tipos de sistemas se dividen en 19 subtipos. [79] Cada tipo y la mayoría de los subtipos se caracterizan por un "gen característico" que se encuentra casi exclusivamente en la categoría. La clasificación también se basa en el complemento de genes cas que están presentes. La mayoría de los sistemas CRISPR-Cas tienen una proteína Cas1. La filogenia de las proteínas Cas1 generalmente concuerda con el sistema de clasificación. [77]Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas, lo que sugiere que son compatibles y pueden compartir componentes. [80] [81] La distribución esporádica de los subtipos CRISPR / Cas sugiere que el sistema CRISPR / Cas está sujeto a la transferencia horizontal de genes durante la evolución microbiana .

Genes distintivos y sus supuestas funciones para los tipos CRISPR-cas mayor y menor.
ClaseTipo casSubtipo casProteína de firmaFunciónReferencia
1I-Cas3ADN nucleasa monocatenaria (dominio HD) y helicasa dependiente de ATP[82] [83]
I ACas8a, Cas5Cas8 es una subunidad del módulo de interferencia que es importante en el direccionamiento del ADN invasor mediante el reconocimiento de la secuencia PAM . Se requiere Cas5 para el procesamiento y la estabilidad de los crRNA[77] [84]
IBCas8b
ICCas8c
IDENTIFICACIÓNCas10dcontiene un dominio homólogo al dominio palm de polimerasas de ácidos nucleicos y ciclasas de nucleótidos[85] [86]
ES DECIRCse1, Cse2
SICsy1, Csy2, Csy3No determinado[77]
IG [Nota 1]GSU0054[87]
III-Cas10Homólogo de Cas10d y Cse1. Se une al ARN objetivo de CRISPR y promueve la estabilidad del complejo de interferencia[86] [88]
III-ACsm2No determinado[77]
III-BCmr5No determinado[77]
III-CCas10 o Csx11[77] [88]
III-DCsx10[77]
III-E[87]
III-F[87]
IV-Csf1[87]
IV-A[87]
IV-B[87]
IV-C[87]
2II-Cas9Las nucleasas RuvC y HNH juntas producen DSB y por separado pueden producir roturas de una sola hebra. Asegura la adquisición de espaciadores funcionales durante la adaptación.[89] [90]
II-ACsn2Proteína de unión al ADN en forma de anillo. Involucrado en la adaptación cebada en el sistema CRISPR Tipo II.[91]
II-BCas4Endonucleasa que trabaja con cas1 y cas2 para generar secuencias espaciadoras[92]
II-CCaracterizado por la ausencia de Csn2 o Cas4[93]
V-Cas12Nuclease RuvC. Carece de HNH.[78] [94]
VirginiaCas12a (Cpf1)[87]
VBCas12b (C2c1)[87]
VCCas12c (C2c3)[87]
enfermedad venéreaCas12d (CasY)[87]
VECas12e (CasX)[87]
VFCas12f (Cas14, C2c10)[87]
VGCas12g[87]
VHCas12h[87]
VICas12i[87]
VK [Nota 2]Cas12k (C2c5)[87]
VUC2c4, C2c8, C2c9[87]
VI-Cas13ARNasa guiada por ARN[78] [95]
VÍACas13a (C2c2)[87]
VI-BCas13b[87]
VI-CCas13c[87]
VI-DCas13d[87]

Mecanismo [ editar ]

Las etapas de la inmunidad CRISPR para cada uno de los tres tipos principales de inmunidad adaptativa. (1) La adquisición comienza con el reconocimiento del ADN invasor por Cas1 y Cas2 y la escisión de un protoespaciador. (2) El protoespaciador se liga a la repetición directa adyacente a la secuencia líder y (3) la extensión de una sola hebra repara el CRISPR y duplica la repetición directa. Las etapas de procesamiento e interferencia de crRNA ocurren de manera diferente en cada uno de los tres principales sistemas CRISPR. (4) La transcripción CRISPR primaria es escindida por genes cas para producir crRNA. (5) En los sistemas de tipo I, Cas6e / Cas6f se escinden en la unión de ssRNA y dsRNA formados por bucles de horquilla en la repetición directa. Los sistemas de tipo II utilizan un ARN trans-activador (tracr) para formar dsRNA, que es escindido por Cas9y RNaseIII. Los sistemas de tipo III utilizan un homólogo de Cas6 que no requiere bucles de horquilla en la repetición directa para la escisión. (6) En los sistemas de tipo II y tipo III, el recorte secundario se realiza en el extremo 5 'o 3' para producir ARNr maduros. (7) Los crRNA maduros se asocian con proteínas Cas para formar complejos de interferencia. (8) En los sistemas de tipo I y tipo II, se requieren interacciones entre la proteína y la secuencia de PAM para la degradación del ADN invasor. Los sistemas de tipo III no requieren un PAM para una degradación exitosa y en los sistemas de tipo III-A se produce un apareamiento de bases entre el crRNA y el mRNA en lugar del ADN, dirigido por los sistemas de tipo III-B.
El locus genético CRISPR proporciona a las bacterias un mecanismo de defensa para protegerlas de infecciones repetidas por fagos.
Transcripciones del locus genético CRISPR y maduración de pre-crRNA
Estructura 3D del complejo de interferencia CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 como herramienta molecular presenta rupturas de ADN de doble hebra específicas.
Las roturas de ADN de doble hebra introducidas por CRISPR-Cas9 permiten una mayor manipulación genética al explotar los mecanismos de reparación del ADN endógeno.

La inmunidad CRISPR-Cas es un proceso natural de bacterias y arqueas. [96] CRISPR-Cas previene la infección por bacteriófagos, la conjugación y la transformación natural al degradar los ácidos nucleicos extraños que ingresan a la célula. [34]

Adquisición de espaciador [ editar ]

Cuando un bacteriófago invade un microbio , la primera etapa de la respuesta inmune es capturar el ADN del fago e insertarlo en un locus CRISPR en forma de espaciador. Cas1 y Cas2 se encuentran en ambos tipos de sistemas inmunológicos CRISPR-Cas, lo que indica que están involucrados en la adquisición de espaciadores. Los estudios de mutación confirmaron esta hipótesis, mostrando que la eliminación de cas1 o cas2 detuvo la adquisición del espaciador, sin afectar la respuesta inmune CRISPR. [97] [98] [99] [100] [101]

Se han caracterizado múltiples proteínas Cas1 y se han resuelto sus estructuras. [102] [103] [104] Las proteínas Cas1 tienen diversas secuencias de aminoácidos . Sin embargo, sus estructuras cristalinas son similares y todas las proteínas Cas1 purificadas son nucleasas / integrasas dependientes de metales que se unen al ADN de manera independiente de la secuencia. [80] proteínas Representante CAS2 se han caracterizado y poseer ya sea (hebra individual) ssRNA- [105] o (doble cadena) dsDNA- [106] [107] específica endoribonuclease actividad.

En el sistema IE de E. coli, Cas1 y Cas2 forman un complejo donde un dímero Cas2 une dos dímeros Cas1. [108] En este complejo, Cas2 desempeña un papel de andamiaje no enzimático, [108] uniendo fragmentos bicatenarios de ADN invasor, mientras que Cas1 une los flancos monocatenarios del ADN y cataliza su integración en matrices CRISPR. [109] [110] [111] Por lo general, se agregan nuevos espaciadores al comienzo del CRISPR junto a la secuencia líder, lo que crea un registro cronológico de las infecciones virales. [112] En E. coli, una proteína similar a una histona llamada factor de integración del huésped ( IHF), que se une a la secuencia líder, es responsable de la precisión de esta integración. [113] IHF también mejora la eficiencia de integración en el sistema de tipo IF de Pectobacterium atrosepticum . [114] pero en otros sistemas pueden ser necesarios diferentes factores de hospedaje [115]

Motivos adyacentes al protospacer [ editar ]

Artículo principal: motivo adyacente del protospacer

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que se escindieron como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que no se seleccionaron al azar, sino que se encontraron adyacentes a secuencias de ADN cortas (3-5 pb) denominadas motivos adyacentes protoespaciadores (PAM). El análisis de los sistemas CRISPR-Cas mostró que los PAM son importantes para los sistemas de tipo I y II, pero no los de tipo III durante la adquisición. [30] [116] [117] [118] [119] [120] En los sistemas tipo I y tipo II, los protoespaciadores se extirpan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador cortado utilizando un mecanismo de regla, manteniendo así la regularidad del tamaño del espaciador en la matriz CRISPR. [121] [122]La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar vinculada evolutivamente a Cas1 y la secuencia líder . [120] [123]

Se agregan nuevos espaciadores a una matriz CRISPR de manera direccional, [28] ocurriendo preferentemente, [76] [116] [117] [124] [125] pero no exclusivamente, adyacentes [119] [122] a la secuencia líder. El análisis del sistema de tipo IE de E. coli demostró que se copia la primera repetición directa adyacente a la secuencia líder, con el espaciador recién adquirido insertado entre la primera y la segunda repeticiones directas. [100] [121]

La secuencia de PAM parece ser importante durante la inserción del espaciador en sistemas de tipo IE. Esa secuencia contiene un nucleótido final fuertemente conservado (nt) adyacente al primer nt del protoespaciador. Este nt se convierte en la base final en la primera repetición directa. [101] [126] [127] Esto sugiere que la maquinaria de adquisición del espaciador genera voladizos monocatenarios en la penúltima posición de la repetición directa y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo, no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen compartir este mecanismo ya que las PAM en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final. [123] Es probable que en esos sistemas, se genere un extremo romo al final de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición.

Variantes de inserción [ editar ]

El análisis de CRISPR de Sulfolobus solfataricus reveló más complejidades al modelo canónico de inserción de espaciadores, ya que uno de sus seis loci CRISPR insertó nuevos espaciadores al azar a lo largo de su matriz CRISPR, en lugar de insertar los más cercanos a la secuencia líder. [122]

Varios CRISPR contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno fue descubierto en el sistema tipo IE de E. coli . Se detectó una mejora significativa en la adquisición del espaciador donde los espaciadores ya apuntan al fago, incluso los desajustes con el protoespaciador. Este 'cebado' requiere que las proteínas Cas involucradas tanto en la adquisición como en la interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores recién adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma hebra que el espaciador de cebado. [101] [126] [127] Esta observación llevó a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición se desliza a lo largo del ADN extraño después de cebar para encontrar un nuevo protoespaciador. [127]

Biogénesis [ editar ]

CRISPR-RNA (crRNA), que luego guía la nucleasa Cas hacia el objetivo durante el paso de interferencia, debe generarse a partir de la secuencia CRISPR. El crRNA se transcribe inicialmente como parte de una única transcripción larga que abarca gran parte de la matriz CRISPR. [26] Esta transcripción luego es escindida por proteínas Cas para formar crRNA. El mecanismo para producir crRNAs difiere entre los sistemas CRISPR / Cas. En los sistemas de tipo IE y tipo IF, las proteínas Cas6e y Cas6f, respectivamente, reconocen los bucles de tallo [128] [129] [130] creados por el emparejamiento de repeticiones idénticas que flanquean el crRNA. [131] Estas proteínas Cas escinden la transcripción más larga en el borde de la región pareada, dejando un solo crRNA junto con un pequeño remanente de la región de repetición pareada.

Los sistemas de tipo III también usan Cas6, sin embargo, sus repeticiones no producen bucles de vástago. En cambio, la escisión se produce por la transcripción más larga que envuelve el Cas6 para permitir la escisión justo aguas arriba de la secuencia repetida. [132] [133] [134]

Los sistemas de tipo II carecen del gen Cas6 y en su lugar utilizan RNaseIII para la escisión. Los sistemas funcionales de tipo II codifican un ARN extrapequeño que es complementario a la secuencia repetida, conocido como ARNcr trans-activador (tracrRNA). [38] La transcripción del tracrRNA y el transcrito primario de CRISPR da como resultado el apareamiento de bases y la formación de dsRNA en la secuencia repetida, que posteriormente es el objetivo de RNaseIII para producir crRNA. A diferencia de los otros dos sistemas, el crRNA no contiene el espaciador completo, que en su lugar está truncado en un extremo. [89]

Los ARNr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Los ARNr no muestran preferencia entre las cadenas codificantes y no codificantes, lo que es indicativo de un sistema de dirección de ADN guiado por ARN. [5] [37] [97] [101] [135] [136] [137] El complejo de tipo IE (comúnmente denominado Cascade) requiere cinco proteínas Cas unidas a un solo crRNA. [138] [139]

Interferencia [ editar ]

Durante la etapa de interferencia en los sistemas de tipo I, la secuencia de PAM se reconoce en la hebra complementaria de crRNA y se requiere junto con la hibridación de crRNA. En los sistemas de tipo I, el apareamiento de bases correcto entre el crRNA y el protoespaciador señala un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II se basan en una única proteína multifuncional, Cas9 , para el paso de interferencia. [89] Cas9 requiere que tanto el crRNA como el tracrRNA funcionen y escinde el ADN utilizando sus dominios de endonucleasa duales HNH y RuvC / RNaseH. El emparejamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago es necesario en los sistemas de tipo II. Sin embargo, el PAM se reconoce en la misma hebra que el crRNA (la hebra opuesta a los sistemas de tipo I).

Los sistemas de tipo III, como el tipo I, requieren seis o siete proteínas Cas que se unen a los crRNA. [140] [141] Los sistemas de tipo III analizados de S. solfataricus y P. furiosus se dirigen al ARNm de los fagos en lugar del genoma del ADN del fago, [81] [141] lo que puede hacer que estos sistemas sean excepcionalmente capaces de dirigirse a fagos basados ​​en ARN genomas. [80] También se encontró que los sistemas de tipo III se dirigen al ADN además del ARN utilizando una proteína Cas diferente en el complejo, Cas10. [142] Se demostró que la escisión del ADN depende de la transcripción. [143]

El mecanismo para distinguir el ADN propio del extraño durante la interferencia está integrado en los ARNcr y, por lo tanto, es probable que sea común a los tres sistemas. A lo largo del proceso de maduración distintivo de cada tipo principal, todos los crRNA contienen una secuencia espaciadora y una parte de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia de repetición parcial la que evita que el sistema CRISPR-Cas se dirija al cromosoma, ya que el emparejamiento de bases más allá de la secuencia espaciadora se señala a sí mismo y evita la escisión del ADN. [144] enzimas CRISPR guiadas-RNA se clasifican como enzimas de restricción de tipo V .

Evolución [ editar ]

Proteína asociada a CRISPR
estructura cristalina de una proteína asociada a crispr de Thermus thermophilus
Identificadores
SímboloCRISPR_assoc
PfamPF08798
Clan pfamCL0362
InterProIPR010179
CDDcd09727
Estructuras proteicas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumresumen de estructura
Proteína Cas2 asociada a CRISPR
estructura cristalina de una proteína hipotética tt1823 de Thermus thermophilus
Identificadores
SímboloCRISPR_Cas2
PfamPF09827
InterProIPR019199
CDDcd09638
Estructuras proteicas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumresumen de estructura
Proteína Cse1 asociada a CRISPR
Identificadores
SímboloCRISPR_Cse1
PfamPF09481
InterProIPR013381
CDDcd09729
Estructuras proteicas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumresumen de estructura

Se cree que los genes cas en los módulos adaptador y efector del sistema CRISPR-Cas han evolucionado a partir de dos módulos ancestrales diferentes. Un elemento similar a un transposón llamado casposón que codifica la integrasa similar a Cas1 y potencialmente otros componentes del módulo de adaptación se insertó junto al módulo efector ancestral, que probablemente funcionó como un sistema inmunológico innato independiente. [145] Los genes cas1 y cas2 altamente conservados del módulo adaptador evolucionaron a partir del módulo ancestral, mientras que una variedad de genes cas efectores de clase 1 evolucionaron a partir del módulo efector ancestral. [146] La evolución de estos diversos genes cas del módulo efector de clase 1 fue guiada por varios mecanismos, como los eventos de duplicación. [147]Por otro lado, cada tipo de módulo efector de clase 2 surgió a partir de inserciones independientes posteriores de elementos genéticos móviles. [148] Estos elementos genéticos móviles tomaron el lugar de los módulos efectores de genes múltiples para crear módulos efectores de un solo gen que producen proteínas grandes que realizan todas las tareas necesarias del módulo efector. [148] Las regiones espaciadoras de los sistemas CRISPR-Cas se toman directamente de elementos genéticos móviles extraños y, por lo tanto, su evolución a largo plazo es difícil de rastrear. [149] Se ha descubierto que la evolución no aleatoria de estas regiones espaciadoras depende en gran medida del medio ambiente y de los elementos genéticos móviles extraños que contiene. [150]

CRISPR / Cas puede inmunizar bacterias contra ciertos fagos y así detener la transmisión. Por esta razón, Koonin describió CRISPR / Cas como un mecanismo de herencia lamarckiano . [151] Sin embargo, esto fue discutido por un crítico que señaló: "Debemos recordar [a Lamarck] por el bien que contribuyó a la ciencia, no por cosas que se parecen a su teoría sólo superficialmente. De hecho, pensar en CRISPR y otros fenómenos como sólo lamarckianos oscurece la forma simple y elegante en que realmente funciona la evolución ". [152] Pero a medida que se han realizado estudios más recientes, se ha hecho evidente que las regiones espaciadoras adquiridas de los sistemas CRISPR-Cas son de hecho una forma de evolución lamarckiana porque son mutaciones genéticas que se adquieren y luego se transmiten. [153]Por otro lado, la evolución de la maquinaria del gen Cas que facilita el sistema evoluciona a través de la evolución darwiniana clásica. [153]

Coevolución [ editar ]

El análisis de las secuencias CRISPR reveló la coevolución de los genomas del huésped y del virus. [154] Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patógenas y comensales . La regulación génica mediada por CRISPR / Cas puede contribuir a la regulación de genes bacterianos endógenos, particularmente durante la interacción con huéspedes eucariotas. Por ejemplo, Francisella novicida usa un ARN único, pequeño, asociado a CRISPR / Cas (scaRNA) para reprimir una transcripción endógena que codifica una lipoproteína bacteriana que es crítica para que F. novicida amortigüe la respuesta del huésped y promueva la virulencia. [155]

El modelo básico de la evolución de CRISPR son los espaciadores recién incorporados que impulsan a los fagos a mutar sus genomas para evitar la respuesta inmune bacteriana, creando diversidad tanto en las poblaciones de fagos como de hospedadores. Para resistir una infección por fagos, la secuencia del espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen del fago diana. Los fagos pueden seguir infectando a sus huéspedes si se producen mutaciones puntuales en el espaciador. [144] Se requiere un rigor similar en PAM o la cepa bacteriana permanece sensible a los fagos. [117] [144]

Tarifas [ editar ]

Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que el 26% de todos los espaciadores eran únicos y que diferentes loci CRISPR mostraban diferentes tasas de adquisición de espaciadores. [116] Algunos loci CRISPR evolucionan más rápidamente que otros, lo que permitió determinar las relaciones filogenéticas de las cepas. Un análisis genómico comparativo mostró que E. coli y S. enterica evolucionan mucho más lentamente que S. thermophilus . Las cepas de este último que divergieron hace 250 mil años todavía contenían el mismo complemento espaciador. [156]

El análisis metagenómico de dos biopelículas de drenaje ácido de minas mostró que uno de los CRISPR analizados contenía deleciones extensas y adiciones de espaciadores en comparación con el otro biofilm, lo que sugiere una mayor actividad / prevalencia de fagos en una comunidad que en la otra. [76] En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que del 7 al 22% de los espaciadores se compartieron durante 17 meses dentro de un individuo, mientras que menos del 2% se compartieron entre los individuos. [125]

Desde el mismo entorno, se rastreó una única cepa utilizando cebadores de PCR específicos para su sistema CRISPR. Los resultados de nivel amplio de presencia / ausencia de espaciador mostraron una diversidad significativa. Sin embargo, este CRISPR agregó 3 espaciadores durante 17 meses, [125] lo que sugiere que incluso en un entorno con una diversidad CRISPR significativa, algunos loci evolucionan lentamente.

Los CRISPR se analizaron a partir de los metagenomas producidos para el proyecto del microbioma humano . [157] Aunque la mayoría eran específicos del sitio del cuerpo, algunos dentro de un sitio del cuerpo se comparten ampliamente entre las personas. Uno de estos loci se originó a partir de especies de estreptococos y contenía aproximadamente 15.000 espaciadores, el 50% de los cuales eran únicos. Al igual que en los estudios específicos de la cavidad bucal, algunos mostraron poca evolución con el tiempo. [157]

La evolución de CRISPR se estudió en quimiostatos utilizando S. thermophilus para examinar directamente las tasas de adquisición del espaciador. En una semana, las cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando se desafiaron con un solo fago. [158] Durante el mismo intervalo, el fago desarrolló polimorfismos de un solo nucleótido que se fijaron en la población, lo que sugiere que el direccionamiento había impedido la replicación del fago en ausencia de estas mutaciones. [158]

Otro experimento de S. thermophilus mostró que los fagos pueden infectar y replicarse en huéspedes que solo tienen un espaciador de dirección. Otro mostró que los huéspedes sensibles pueden existir en entornos con altos títulos de fagos. [159] Los estudios de quimiostato y de observación sugieren muchos matices de CRISPR y la (co) evolución de fagos.

Identificación [ editar ]

Los CRISPR se distribuyen ampliamente entre bacterias y arqueas [85] y muestran algunas similitudes de secuencia. [131] Su característica más notable son sus espaciadores repetidos y sus repeticiones directas. Esta característica hace que los CRISPR sean fácilmente identificables en secuencias largas de ADN, ya que el número de repeticiones disminuye la probabilidad de una coincidencia falsa positiva. [160]

El análisis de CRISPR en datos metagenómicos es más desafiante, ya que los loci CRISPR normalmente no se ensamblan, debido a su naturaleza repetitiva oa través de la variación de tensión, lo que confunde los algoritmos de ensamblaje. Cuando hay muchos genomas de referencia disponibles, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar matrices CRISPR y analizar el contenido del espaciador. [116] [125] [161] [162] [163] [164] Sin embargo, este enfoque proporciona información solo para CRISPR específicamente dirigidos y para organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para diseñar una reacción en cadena de la polimerasa confiable(PCR) cebadores. Se pueden usar cebadores específicos de repetición degenerados para amplificar espaciadores CRISPR directamente de muestras ambientales; Los amplicones que contienen dos o tres espaciadores se pueden ensamblar computacionalmente para reconstruir matrices CRISPR largas. [164]

La alternativa es extraer y reconstruir matrices CRISPR a partir de datos metagenómicos de escopeta. Esto es computacionalmente más difícil, particularmente con tecnologías de secuenciación de segunda generación (por ejemplo, 454, Illumina), ya que las longitudes de lectura cortas evitan que aparezcan más de dos o tres unidades repetidas en una sola lectura. La identificación CRISPR en lecturas sin procesar se ha logrado mediante la identificación puramente de novo [165] o mediante el uso de secuencias repetidas directas en matrices CRISPR parcialmente ensambladas de contigs (segmentos de ADN superpuestos que juntos representan una región de consenso de ADN) [157] y secuencias repetidas directas de publicó genomas [166] como un gancho para identificar repeticiones directas en lecturas individuales.

Uso por fagos [ editar ]

Otra forma de que las bacterias se defiendan de la infección por fagos es tener islas cromosómicas . Un subtipo de islas cromosómicas llamado isla cromosómica inducible por fagos (PICI) se escinde de un cromosoma bacteriano tras la infección por fagos y puede inhibir la replicación del fago. [167]Los PICI son inducidos, escindidos, replicados y finalmente empaquetados en pequeñas cápsides por ciertos fagos estafilocócicos templados. Los PICI utilizan varios mecanismos para bloquear la reproducción de fagos. En el primer mecanismo, Ppi codificado por PICI bloquea diferencialmente la maduración del fago al unirse o interactuar específicamente con el fago TerS, por lo tanto bloquea la formación del complejo del fago TerS / TerL responsable del empaquetamiento del ADN del fago. En el segundo mecanismo, PICI CpmAB redirige la proteína morfogenética de la cápside del fago para hacer que el 95% de la cápside del tamaño de SaPI y el ADN del fago puedan empaquetar solo 1/3 de su genoma en esta pequeña cápside y, por lo tanto, convertirse en fagos no viables. [168]El tercer mecanismo involucra dos proteínas, PtiA y PtiB, que se dirigen a la LtrC, que es responsable de la producción de proteínas de virión y lisis. Este mecanismo de interferencia está modulado por una proteína moduladora, PtiM, que se une a una de las proteínas mediadoras de interferencia, PtiA, y por lo tanto logra el nivel de interferencia requerido. [169]

Un estudio mostró que el fago lítico ICP1, que se dirige específicamente al serogrupo O1 de Vibrio cholerae , ha adquirido un sistema CRISPR / Cas que se dirige a un elemento similar a PICI de V. cholera . El sistema tiene 2 loci CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser homólogo al sistema IF que se encuentra en Yersinia pestis . Además, al igual que el sistema bacteriano CRISPR / Cas, ICP1 CRISPR / Cas puede adquirir nuevas secuencias, lo que permite que el fago y el huésped co-evolucionen. [170]

Se demostró que ciertos virus de arqueas llevan matrices mini-CRISPR que contienen uno o dos espaciadores. Se ha demostrado que los espaciadores dentro de las matrices CRISPR transmitidas por virus se dirigen a otros virus y plásmidos, lo que sugiere que las matrices mini-CRISPR representan un mecanismo de exclusión de superinfección heterotípica y participan en conflictos intervirales. [164]

Aplicaciones [ editar ]

Edición de genes CRISPR [ editar ]

Artículo principal: edición de genes CRISPR

La tecnología CRISPR se ha aplicado en las industrias alimentaria y agrícola para diseñar cultivos probióticos e inmunizar cultivos industriales (para yogur, por ejemplo) contra infecciones. También se utiliza en cultivos para mejorar el rendimiento, la tolerancia a la sequía y el valor nutricional. [171]

A finales de 2014 se habían publicado unos 1000 artículos de investigación que mencionaban CRISPR. [172] [173] La tecnología se había utilizado para inactivar funcionalmente genes en líneas celulares y células humanas, para estudiar Candida albicans , para modificar levaduras utilizadas para producir biocombustibles y para modificar genéticamente cepas de cultivos . [173] CRISPR también se puede utilizar para cambiar mosquitos para que no puedan transmitir enfermedades como la malaria. [174] Los enfoques basados ​​en CRISPR que utilizan Cas12a se han utilizado recientemente en la modificación con éxito de un gran número de especies de plantas. [175]

En julio de 2019, CRISPR se utilizó para tratar experimentalmente a un paciente con un trastorno genético. La paciente era una mujer de 34 años con anemia drepanocítica . [176]

En febrero de 2020, se avanzó en los tratamientos contra el VIH con un 60-80% del ADN eliminado en ratones y algunos estaban completamente libres del virus después de ediciones que involucraron CRISPR y LASER ART . [177]

En marzo de 2020, se inyectó virus modificado con CRISPR en el ojo de un paciente en un intento de tratar la amaurosis congénita de Leber . [178]

En el futuro, la edición de genes CRISPR podría potencialmente usarse para crear nuevas especies o revivir especies extintas de otras estrechamente relacionadas. [179]

Las reevaluaciones basadas en CRISPR de las afirmaciones de las relaciones entre genes y enfermedades han llevado al descubrimiento de anomalías potencialmente importantes. [180]

CRISPR como herramienta de diagnóstico [ editar ]

Las nucleasas asociadas a CRISPR han demostrado ser útiles como herramienta para las pruebas moleculares debido a su capacidad para apuntar específicamente a secuencias de ácido nucleico en un fondo elevado de secuencias no diana. En 2016, la nucleasa Cas9 se utilizó para agotar las secuencias de nucleótidos no deseadas en bibliotecas de secuenciación de próxima generación, mientras que solo requería 250 picogramos de entrada de ARN inicial. [181] A partir de 2017, las nucleasas asociadas a CRISPR también se utilizaron para pruebas de diagnóstico directo de ácidos nucleicos, hasta la sensibilidad de una sola molécula. [182] [183]

Al acoplar los diagnósticos basados ​​en CRISPR a procesos enzimáticos adicionales, es posible la detección de moléculas más allá de los ácidos nucleicos. Un ejemplo de tecnología acoplada es la elaboración de perfiles de transcripción in vitro (SPRINT) basada en SHERLOCK. SPRINT se puede utilizar para detectar una variedad de sustancias, como metabolitos en muestras de pacientes o contaminantes en muestras ambientales, con alto rendimiento o con dispositivos portátiles en el punto de atención. [184] Las plataformas CRISPR / Cas también se están explorando para la detección [185] [186] [187] [188] [189] y la inactivación del nuevo coronavirus, SARS-CoV-2. [190]

Diagrama de flujo esquemático de los métodos de detección molecular del virus COVID-19; doi.org/10.7717/peerj.10180

Ver también [ editar ]

  • Anti-CRISPR
  • Herramientas CRISPR / Cas
  • Edición de genes CRISPR
  • El diario CRISPR
  • DRACO
  • Nocaut genético
  • Genética
  • Pantallas de eliminación de CRISPR-Cas9 en todo el genoma
  • Glosario de genética
  • Human Nature (documental de 2019)
  • Edición principal
  • ARNi
  • ARNip
  • Ensayo de nucleasa de topógrafo
  • Biología sintética
  • Dedo de zinc

Notas [ editar ]

  1. ^ El subtipo IG se conocía anteriormente como subtipo IU . [77]
  2. ^ El subtipo VK se conocía anteriormente como subtipo VU 5. [87]

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External links[edit]

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