Nació en Jérez de la Frontera , España . De Ampudia participó en la fundación española de muchos pueblos y ciudades. Participó en las conquistas de Nicaragua, Perú, Ecuador y Colombia . De Ampudia acompañó a Pedro de Alvarado al Perú y luego participó en la fundación de la ciudad de San Francisco de Quito el 6 de diciembre de 1534. Su nombre puede leerse en el atrio de la Catedral Metropolitana de Quito.
Juan de Ampudia fue, con Diego de Tapia , uno de los primeros alcaldes del gobierno de la ciudad de Quito. También creó la primera fábrica de tejas en la ladera de un cerro que ahora se llama "El Tejar". Ayudó a Sebastián de Belalcázar a pacificar el área alrededor de Quito y mató a Zopozopanqui, un cacique local, lo que llevó a la rebelión contra los españoles. Murió en Popayán .
El Capitán De Ampudia se unió a la expedición de Pedro de Añasco y fundó el pueblo de Timbío el 1 de noviembre de 1535. Realizó numerosas expediciones por el río Cauca donde adquirió el nombre de guerra "Atila del Cauca". [ cita requerida ] El 24 de diciembre de 1536 él y sus tropas tomaron el cerro llamado El Azafate para asegurar la ruta que tomaría De Belalcázar para fundar la ciudad de Popayán el 13 de enero de 1537. Por órdenes de Benalcázar fue tras la rebelde al capitán Osorio y murió de heridas de lanza en su camino de regreso a Popayán en 1541.