Los transportadores de magnesio son proteínas que transportan magnesio a través de la membrana celular . Todas las formas de vida requieren magnesio , sin embargo, los mecanismos moleculares de la absorción de Mg 2+ del medio ambiente y la distribución de este elemento vital dentro del organismo se están dilucidando lentamente.
La función ATPasa de MgtA depende en gran medida de la cardiolipina y se ha demostrado que detecta magnesio libre en el rango de μM [1]
En las bacterias, el Mg 2+ es probablemente suministrado principalmente por la proteína CorA [2] y, cuando la proteína CorA está ausente, por la proteína MgtE . [3] [4] En la levadura, la captación inicial es a través de las proteínas Alr1p y Alr2p, [5] pero en esta etapa, la única proteína distribuidora de Mg 2+ interna identificada es Mrs2p. [6] Dentro de los protozoos, solo se ha identificado un transportador de Mg 2+ (XntAp). [7] En los metazoos, se han identificado los homólogos de Mrs2p [8] y MgtE [9] , junto con dos nuevos sistemas de transporte de Mg 2+ TRPM6 / TRPM7 [10][11] y PCLN-1. [12] Finalmente, en las plantas, se ha identificado una familia de homólogos de Mrs2p [13] [14] junto con otra proteína nueva, AtMHX. [15]
Evolución
La evolución del transporte de Mg 2+ parece haber sido bastante complicada. Las proteínas aparentemente basadas en MgtE están presentes en bacterias y metazoos, pero faltan en hongos y plantas, mientras que proteínas aparentemente relacionadas con CorA están presentes en todos estos grupos. Los dos transportadores de transporte activos presentes en las bacterias, MgtA y MgtB, no parecen tener ninguna homología en organismos superiores. También existen sistemas de transporte de Mg 2+ que se encuentran solo en los organismos superiores.
Tipos
Hay una gran cantidad de proteínas aún por identificar que transportan Mg 2+ . Incluso en el eucariota mejor estudiado, la levadura, Borrelly [16] ha informado de un intercambiador de Mg 2+ / H + sin una proteína asociada, que probablemente se localiza en el Golgi. Al menos otro transportador principal de Mg 2+ en la levadura aún no se ha contabilizado, el que afecta el transporte de Mg 2+ dentro y fuera de la vacuola de la levadura. En organismos multicelulares superiores, parece que muchas proteínas transportadoras de Mg 2+ esperan ser descubiertas.
Los transportadores de Mg 2+ que contienen el dominio CorA (CorA, similar a Alr y similar a Mrs2) tienen una matriz similar pero no idéntica de afinidades por los cationes divalentes. De hecho, esta observación puede extenderse a todos los transportadores de Mg 2+ identificados hasta ahora. Esta similitud sugiere que las propiedades básicas del Mg 2+ influyen fuertemente en los posibles mecanismos de reconocimiento y transporte. Sin embargo, esta observación también sugiere que el uso de otros iones metálicos como trazadores para la absorción de Mg 2+ no producirá necesariamente resultados comparables a la capacidad del transportador para transportar Mg 2+ . Idealmente, el Mg 2+ debería medirse directamente. [17]
Dado que 28 Mg 2+ es prácticamente imposible de obtener, muchos de los datos antiguos deberán reinterpretarse con nuevas herramientas para medir el transporte de Mg 2+ , si se van a comparar directamente diferentes transportadores. El trabajo pionero de Kolisek [18] y Froschauer [19] utilizando mag-fura 2 ha demostrado que el Mg 2+ libre puede medirse de forma fiable in vivo en algunos sistemas. Al volver al análisis de CorA con esta nueva herramienta, hemos obtenido una base importante para el análisis de nuevos sistemas de transporte de Mg 2+ a medida que se descubren. Sin embargo, es importante que la cantidad de transportador presente en la membrana se determine con precisión si se van a realizar comparaciones de la capacidad de transporte. Este sistema bacteriano también podría proporcionar alguna utilidad para el análisis de proteínas transportadoras de Mg 2+ eucariotas , pero las diferencias en los sistemas biológicos de procariotas y eucariotas deberán considerarse en cualquier experimento.
Función
Comparar las funciones de las proteínas de transporte de Mg 2+ caracterizadas es actualmente casi imposible, a pesar de que las proteínas se han investigado en diferentes sistemas biológicos utilizando diferentes metodologías y tecnologías. Encontrar un sistema en el que se puedan comparar directamente todas las proteínas sería un gran avance. Si se pudiera demostrar que las proteínas son funcionales en bacterias ( S. typhimurium ), entonces una combinación de las técnicas de mag-fura 2, la cuantificación de la proteína en la membrana de la envoltura y la estructura de las proteínas (cristal de rayos X o crio- TEM) podría permitir la determinación de los mecanismos básicos involucrados en el reconocimiento y transporte del ion Mg 2+ . Sin embargo, quizás el mejor avance sería el desarrollo de métodos que permitan medir la función de la proteína en el sistema patch-clamp utilizando membranas artificiales.
Bacterias
Investigaciones tempranas
En 1968, Lusk [20] describió la limitación del crecimiento bacteriano ( Escherichia coli ) en medios pobres en Mg 2+ , sugiriendo que las bacterias requerían Mg 2+ y era probable que tomaran activamente este ion del medio ambiente. Al año siguiente, el mismo grupo [21] y otro grupo, Silver, [22] describieron de forma independiente la captación y salida de Mg 2+ en células de E. coli metabólicamente activas utilizando 28 Mg 2+ . A finales de 1971, se habían publicado dos artículos que describían la interferencia de Co 2+ , Ni 2+ y Mn 2+ en el transporte de Mg 2+ en E. coli [23] y en Aerobacter aerogenes y Bacillus megaterium. [24] En el último desarrollo importante antes de la clonación de los genes que codifican los transportadores, se descubrió que había un segundo sistema de captación de Mg 2+ que mostraba una afinidad y una cinética de transporte similares al primer sistema, pero que tenía un rango diferente de sensibilidades. a los cationes que interfieren. Este sistema también fue reprimido por altas concentraciones extracelulares de Mg 2+ . [25] [26]
CorA
El gen CorA y su proteína correspondiente son el sistema de transporte de Mg 2+ más estudiado en cualquier organismo. La mayor parte de la literatura publicada sobre el gen CorA proviene del laboratorio de ME Maguire. Recientemente, el grupo de RJ Schweyen tuvo un impacto significativo en la comprensión del transporte de Mg 2+ por parte de CorA. El gen fue nombrado originalmente por el fenotipo resistente al cobalto en E. coli que fue causado por la inactivación del gen. [25]
El gen fue identificado genéticamente en E. coli por Park et al. , [26] pero no se clonó hasta que Hmiel et al. [2] aisló el homólogo de Salmonella enterica serovar Typhimurium ( S. typhimurium ). Más tarde, Smith y Maguire [27] demostrarían que el gen CorA estaba presente en 17 bacterias gramnegativas. Con la gran cantidad de secuencias genómicas completas disponibles para los procariotas, se ha demostrado que CorA es prácticamente ubicua entre las eubacterias, además de estar ampliamente distribuida entre las arqueas. [28] El locus CorA en E. coli contiene un único marco de lectura abierto de 948 nucleótidos, que produce una proteína de 316 aminoácidos. Esta proteína está bien conservada entre las Eubacterias y Archaea. Entre E. coli y S. typhimurium , las proteínas son 98% idénticas, pero en especies más distantes, la similitud cae entre el 15 y el 20%. [28] En los genes relacionados más lejanamente, la similitud a menudo se restringe a la parte C-terminal de la proteína, y un motivo de aminoácidos corto GMN dentro de esta región está muy altamente conservado. El dominio CorA, también conocido como PF01544 en la base de datos de dominios de proteínas conservadas pFAM ( http://webarchive.loc.gov/all/20110506030957/http%3A//pfam.sanger.ac.uk/ ), también está presente en un amplia gama de organismos superiores, y estos transportadores se revisarán a continuación.
El gen CorA se expresa constitutivamente en S. typhimurium bajo una amplia gama de concentraciones externas de Mg 2+ . [29] Sin embargo, evidencia reciente sugiere que la actividad de la proteína puede estar regulada por el sistema regulador de dos componentes PhoPQ . [30] Este sensor responde a bajas concentraciones externas de Mg 2+ durante el proceso de infección de S. typhimurium en humanos. [31] En condiciones de Mg 2+ externo bajo , se informó que el sistema PhoPQ suprime la función de CorA y se ha demostrado previamente que la transcripción de los transportadores Mg 2+ alternativos MgtA y MgtB se activa en estas condiciones. [29] Chamnongpol y Groisman sugieren que esto permite que las bacterias escapen de la toxicidad de los iones metálicos causada por el transporte de otros iones, particularmente Fe (II), por CorA en ausencia de Mg 2+ . [30] Papp y Maguire ofrecen un informe contradictorio sobre la fuente de la toxicidad. [32]
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/f/f3/Cora_mag.png/300px-Cora_mag.png)
La figura (no a escala) muestra la topología del dominio transmembrana (TM) publicada originalmente de la proteína CorA de S. typhimurium , que se dice que tiene tres regiones que atraviesan la membrana en la parte C-terminal de la proteína (mostrada en azul), según lo determinado por Smith et al. . [33] Warren et al. Publicaron pruebas de que CorA actúa como homotetrámero . en 2004. [34] En diciembre de 2005, la estructura cristalina del canal CorA se publicó en la base de datos de estructura de proteínas RSCB. Los resultados mostraron que la proteína tiene dos dominios TM y existe como un homopentámero, en conflicto directo con los informes anteriores. Siga este enlace para ver la estructura en 3D . Las partes intracelulares solubles de la proteína están muy cargadas y contienen 31 residuos con carga positiva y 53 con carga negativa. Por el contrario, los dominios TM contienen solo un aminoácido cargado, que se ha demostrado que no es importante en la actividad del transportador. [35] A partir de experimentos de mutagénesis, parece que la química del transporte de Mg 2+ se basa en los grupos hidroxilo que recubren el interior del poro de transporte; También existe un requisito absoluto para el motivo GMN (mostrado en rojo). [35] [36]
Antes de que la actividad de CorA pudiera estudiarse in vivo , cualquier otro sistema de transporte de Mg 2+ en el huésped bacteriano tuvo que ser identificado e inactivado o eliminado (ver más abajo). Se construyó una cepa de S. typhimurium que contiene un gen CorA funcional pero que carece de MgtA y MgtB [37] (ver también más abajo), y se analizó la cinética de absorción del transportador. [38] Esta cepa mostró tasas de crecimiento casi normales en medios estándar (50 μM Mg 2+ ), pero la eliminación de los tres genes creó una cepa bacteriana que requiere 100 mM de Mg 2+ externo para un crecimiento normal. [37]
El Mg 2+ se transporta a las células que contienen sólo el sistema de transporte CorA con cinéticas y sensibilidades catiónicas similares a la captación de Mg 2+ descrita en los artículos anteriores, y además se ha cuantificado [38] (ver tabla). Se observó que la captación de Mg 2+ se estabilizaba como en estudios anteriores, y aunque no se ha determinado ningún mecanismo real para la disminución del transporte, se ha asumido que la proteína está inactivada. [19] Co 2+ y Ni 2+ son tóxicos para las células de S. typhimurium que contienen una proteína CorA funcional y esta toxicidad se debe al bloqueo de la captación de Mg 2+ (inhibición competitiva) y la acumulación de estos iones dentro de la célula. [2] Se ha demostrado que Co 2+ y Ni 2+ son transportados por CorA mediante análisis de trazadores radiactivos, [2] [39] aunque con afinidades (km) y velocidades (Vmax) más bajas que para Mg 2+ (ver tabla ). Los valores de km para Co 2+ y Ni 2+ están significativamente por encima de los que se espera que encuentren las células en su entorno normal, por lo que es poco probable que el sistema de transporte CorA medie la absorción de estos iones en condiciones naturales. [2] Hasta la fecha, la evidencia del transporte de Mn 2+ por CorA se limita a E. coli . [26]
Mg 2+ | Co 2+ | Ni 2+ | |
---|---|---|---|
km (μM) | 15 | 30 | 240 |
Vmax (pmol / min / 108 células) | 250 | 500 | 360 |
Ki (μM) - Mg | - | - | 10 |
Ki (μM) - Co | 50 | - | 20 |
Ki (μM) - Mn | 30 | - | - |
Ki (μM) - Ni | 300 | - | 300 |
La tabla enumera la cinética de transporte del sistema de transporte CorA Mg 2+ . Esta tabla ha sido compilada a partir de las publicaciones de Snavely et al. (1989b), [38] Gibson et al. (1991) [39] y Smith et al. (1998a) [35] y resume los datos cinéticos de la proteína de transporte de CorA expresada a partir del promotor de tipo salvaje en bacterias que carecen de MgtA y MgtB. km y Vmax se determinaron a 20 ° C ya que la absorción de Mg 2+ a 37 ° C era demasiado rápida para medirla con precisión.
Recientemente, la fluorescencia dependiente de Mg 2+ de mag-fura 2 se utilizó para medir el contenido de Mg 2+ libre de las células de S. typhimurium en respuesta al Mg 2+ externo , lo que mostró que CorA es el principal sistema de absorción de Mg 2+ en bacterias. [19] Los autores también demostraron por primera vez que los cambios en el potencial eléctrico (ΔΨ) a través de la membrana plasmática de la célula afectaron tanto la tasa de absorción de Mg 2+ como el contenido de Mg 2+ libre de la célula; la despolarización suprimió el transporte, mientras que la hiperpolarización incrementó el transporte. La cinética de transporte se definió solo por la tasa de cambio de Mg 2+ libre dentro de las células (250 μM s -1 ). Debido a que no se realizó una cuantificación de la cantidad de proteína CorA en la membrana, este valor no se puede comparar con otros experimentos en transportadores de Mg 2+ . [18]
El flujo de salida de Mg 2+ de las células bacterianas fue observado por primera vez por Lusk y Kennedy (1969) [21] y está mediado por el sistema de transporte CorA Mg 2+ en presencia de altas concentraciones extracelulares de Mg 2+ . [38] El flujo de salida también puede ser provocado por Co 2+ , Mn 2+ y Ni 2+ , aunque no en el mismo grado que el Mg 2+ . [23] No se observó salida de Co 2+ a través del sistema de transporte de CorA. El proceso de salida de Mg 2+ requiere además uno de los genes CorB, CorC o CorD. [39] La mutación de cualquiera de estos genes conduce a una resistencia al Co 2+ un poco menos de la mitad de la proporcionada por un mutante CorA. Este efecto puede deberse a la inhibición de la pérdida de Mg 2+ que de otro modo se produciría en presencia de niveles elevados de Co 2+ . Actualmente se desconoce si el Mg 2+ es más tóxico cuando se eliminan los genes CorBCD.
Se ha especulado que el ion Mg 2+ interactuará inicialmente con cualquier proteína de transporte a través de su capa de hidratación. [40] Cobalto (III) hexaamina, Co (III) Hex, es un análogo unido covalentemente (no lábil) de la primera capa de hidratación de varios cationes divalentes, incluido el Mg 2+ . El radio de la molécula Co (III) Hex es de 244 pm, muy similar al radio de 250 pm de la primera capa de hidratación de Mg 2+ . Este análogo es un potente inhibidor del sistema de transporte CorA, más que Mg 2+ , Co 2+ o Ni 2+ . [41] La fuerza adicional de la inhibición de Co (III) Hex podría provenir del bloqueo del poro de transporte debido a la incapacidad de la proteína para "deshidratar" el sustrato. También se demostró que el Co (III) Hex no se transportaba al interior de las células, [41] lo que sugiere que se requeriría al menos una deshidratación parcial para el transporte del sustrato normal (Mg 2+ ). La hexaamina de níquel (II), con un radio de 255 pm, no inhibió el sistema de transporte de CorA, lo que sugiere que existe un límite de tamaño máximo para la unión del ion sustrato de CorA. [41] Estos resultados sugieren que la propiedad importante involucrada en el reconocimiento de Mg 2+ por CorA es el tamaño del ion con su primera capa de hidratación. Por lo tanto, el cambio de volumen generalmente citado para el ion Mg 2+ desnudo a hidratado de más de 500 veces, incluida la segunda esfera de hidratación, puede no ser biológicamente relevante y puede ser una razón para el cambio de volumen de la primera esfera de 56- pliegue para ser de uso más común.
MgtA y MgtB
La presencia de estos dos genes se sospechó por primera vez cuando Nelson y Kennedy (1972) [25] mostró que había Mg 2+ -repressible y no reprimible Mg 2+ captación sistemas en E. coli . La absorción no reprimible de Mg 2+ está mediada por la proteína CorA. En S. typhimurium, finalmente se demostró que la captación reprimible de Mg 2+ era a través de las proteínas MgtA y MgtB. [37]
Tanto MgtA como MgtB están regulados por el sistema PhoPQ y se transcriben activamente durante el proceso de infección de pacientes humanos por S. typhimurium . [31] [42] [43] Aunque ninguno de los genes es necesario para la patogenicidad, la proteína MgtB mejora la supervivencia a largo plazo del patógeno en la célula. [44] Los genes también se regulan positivamente in vitro cuando la concentración de Mg 2+ cae por debajo de 50 µM (Snavely et al. , 1991a). Aunque las proteínas tienen valores de km similares a CorA y velocidades de transporte aproximadamente 10 veces menores, los genes pueden ser parte de un sistema de barrido de Mg 2+ . Chamnongpol y Groisman (2002) presentan evidencia de que el papel de estas proteínas puede ser compensar la inactivación de la proteína CorA por el regulón PhoPQ. [30] Los autores sugieren que la proteína CorA se inactiva para permitir evitar la toxicidad del metal a través de la proteína en los ambientes bajos en Mg 2+ a los que las células están sometidas a S. typhimurium después de la infección.
Las proteínas son ambas ATPasas de tipo P [38] [45] y ninguno de los genes muestra ninguna similitud con CorA. Las proteínas MgtA y MgtB son 75% similares (50% idénticas), aunque parece que MgtB puede haber sido adquirido por transferencia horizontal de genes como parte de Salmonella Pathogenicity Island 3. [45] [46] La topología TM de la proteína MgtB ha se ha determinado experimentalmente, mostrando que la proteína tiene diez hélices que atraviesan TM con los extremos de la proteína en el citoplasma (ver figura). El MgtA está presente en bacterias muy divergentes, pero no es tan común como CorA, mientras que el MgtB parece tener una distribución bastante restringida. [47] No se han sugerido hipótesis para la distribución inusual.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/7/70/Mgta-b_mag.png)
La figura, adaptada de Smith et al. (1993b), [48] muestra la topología de membrana determinada experimentalmente de la proteína MgtB en S. typhimurium . Los dominios TM se muestran en azul claro y se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los extremos N y C terminales. La figura no está dibujada a escala.
Si bien las proteínas MgtA y MgtB son muy similares, muestran algunas diferencias menores en la actividad. El MgtB es muy sensible a la temperatura, perdiendo toda actividad (con respecto al transporte de Mg 2+ ) a una temperatura de 20 ° C. [38] Además, MgtB y MgtA son inhibidos por diferentes rangos de cationes (Tabla A10.1 [38] ).
La tabla enumera las características de transporte de cationes de las proteínas MgtA y MgtB en S. typhimurium , así como los datos cinéticos de las proteínas de transporte MgtA y MgtB a 37 ° C. [38] Los números de Vmax que figuran entre paréntesis son los correspondientes a la absorción a 20 ° C. La inhibición del transporte de Mg 2+ por Mn 2+ a través de MgtA mostró una cinética inusual (ver Figura 1 de Snavely et al. , 1989b [38] )
Mg 2+ | Co 2+ | ||||
---|---|---|---|---|---|
km (μM) | Vmax (pmol / min / 108 células) | Ki (μM) | |||
Co 2+ | Mn 2+ | Ni 2+ | |||
MgtA | 29 | 115 (24) | 40 | X | 30 |
MgtB | 6 | 75 (<2) | 8 | 40 | 13 |
Las proteínas MgtA y MgtB son ATPasas, que utilizan una molécula de ATP por ciclo de transporte, mientras que la captación de Mg 2+ a través de CorA es simplemente electroquímicamente favorable. Chamnongpol y Groisman (2002) han sugerido que las proteínas MgtA y MgtB forman parte de un sistema de evitación de la toxicidad de los metales. [30] Alternativamente, como la mayoría de las ATPasas de tipo P funcionan como transportadores mediadores de salida, se ha sugerido que las proteínas MgtA y MgtB actúan como proteínas de salida para un catión actualmente no identificado, y el transporte de Mg 2+ es inespecífico o intercambiado a mantener la electro-neutralidad del proceso de transporte. [49] Se necesitarán más experimentos para definir la función fisiológica de estas proteínas.
MgtE
MgtE | ||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
![]() Estructura cristalina del transportador de magnesio MgtE. PDB 2zy9
[50] | ||||||||
Identificadores | ||||||||
Símbolo | MgtE | |||||||
Pfam | PF01769 | |||||||
InterPro | IPR006667 | |||||||
TCDB | 1.A.26 | |||||||
Proteína OPM | 2yvx | |||||||
|
Dos artículos describen MgtE, una cuarta proteína de absorción de Mg 2+ en bacterias no relacionadas con MgtA / B o CorA. [3] [4] Este gen ha sido secuenciado y se predice que la proteína, de 312 aminoácidos de tamaño, contiene cuatro o cinco dominios que abarcan TM que están dispuestos de cerca en la parte C-terminal de la proteína (ver figura). Esta región de la proteína se ha identificado en la base de datos de Pfam como un dominio de proteína conservada (PF01769) y las especies que contienen proteínas que tienen este dominio de proteína se distribuyen aproximadamente por igual en Eubacteria y Archaea, aunque es bastante raro en comparación con la distribución de CorA. Sin embargo, la diversidad de las proteínas que contienen el dominio es significativamente mayor que la del dominio CorA. La base de datos Pfam enumera siete grupos distintos de dominios MgtE que contienen proteínas, de los cuales seis contienen un miembro arcaico o eubacteriano. La expresión de MgtE está frecuentemente controlada por una estructura de ARN conservada, líder YkoK o caja M. [51]
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/c/c1/MGTE.png)
La figura (derecha), adaptada de Smith et al. (1995) [4] y la entrada de la base de datos PFAM, muestra la topología de membrana predicha por computadora de la proteína MgtE en Bacillus firmus OF4. Los dominios de TM se muestran en azul claro. Los dominios CBS , llamados así por la proteína en la que se identificaron, cistationina-beta sintasa , que se muestran en naranja, se identifican en la base de datos Pfam como dominios reguladores, pero el mecanismo de acción aún no se ha descrito. Se encuentran en varios canales de cloruro activados por voltaje. [52] Se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los terminales N y C. Esta figura no está dibujada a escala. Este transportador ha tenido recientemente su estructura resuelta por cristalografía de rayos X. [53]
El gen MgtE fue identificado por primera vez por Smith et al. (1995) durante un cribado de proteínas similares a CorA en bacterias y complementa la cepa de S. typhimurium deficiente en la absorción de Mg 2+ MM281 (corA mgtA mgtB), restaurando el crecimiento de tipo salvaje en medios estándar. [4] No se determinó la cinética del transporte de Mg 2+ para la proteína, ya que 28 Mg 2+ no estaba disponible. Como sustituto, se midió la captación de 57 Co 2+ y se demostró que tiene un km de 82 μM y una Vmax de 354 pmol min -1 10 8 células -1 . El Mg 2+ era un inhibidor competitivo con una Ki de 50 µM; la Ki de la inhibición de Mg 2+ de la captación de 60 Co 2+ a través de CorA es de 10 µM. [2] En la tabla se muestra una comparación de los datos cinéticos disponibles para MgtA y CorA. Claramente, MgtE no transporta Co 2+ en el mismo grado que CorA, y la inhibición del transporte por Mg 2+ también es menos eficiente, lo que sugiere que la afinidad de MgtE por Mg 2+ es menor que la de CorA. El inhibidor más fuerte de la captación de Co 2+ fue Zn 2+ , con una Ki de 20 µM. [4] El transporte de Zn 2+ por esta proteína puede ser tan importante como el de Mg 2+ .
Mg 2+ | Co 2+ | ||||
---|---|---|---|---|---|
km (μM) | Vmax (pmol / min / 108 células) | km (μM) | Vmax (pmol / min / 108 células) | Ki (Mg 2+ ) (μM) | |
MgtE | - | - | 82 [4] (a 37 ° C) | 354 [4] (a 37 ° C) | 50 [4] (a 37 ° C) |
CorA | 15 [38] (a 20 ° C) | 250 [38] (a 20 ° C) | 30 [2] (a 22 ° C) | 500 [2] (a 22 ° C) | 10 [2] (a 22 ° C) |
La tabla muestra una comparación de la cinética de transporte de MgtE y CorA, y se enumeran los valores de los parámetros cinéticos clave para ellos. Como se muestra, los datos se han generado a diferentes temperaturas de incubación. km y Ki no se alteran significativamente por la diferente temperatura de incubación. Por el contrario, Vmax muestra una fuerte correlación positiva con la temperatura, por lo que el valor de Co 2+ Vmax para MgtE no es directamente comparable con los valores de CorA.
Levadura
Investigaciones tempranas
La investigación más temprana que muestra que la levadura absorbe Mg 2+ parece haber sido realizada por Schmidt et al. (1949). Sin embargo, estos autores solo mostraron un contenido alterado de Mg 2+ de levadura en una tabla dentro del documento, y las conclusiones del informe se referían completamente al metabolismo del fosfato. Una serie de experimentos de Rothstein [54] [55] cambió el enfoque más hacia la captación de los cationes metálicos, mostrando que la levadura capta cationes con la siguiente serie de afinidad; Mg 2+ , Co 2+ , Zn 2+ > Mn 2+ > Ni 2+ > Ca 2+ > Sr 2+ . Además, se sugirió que el transporte de los diferentes cationes está mediado por el mismo sistema de transporte [55] [56] [57] [58] , una situación muy parecida a la de las bacterias.
En 1998, MacDiarmid y Gardner finalmente identificaron las proteínas responsables del fenotipo de transporte de cationes observado en Saccharomyces cerevisiae . [5] Los genes involucrados en este sistema y un segundo sistema de transporte mitocondrial de Mg 2+ , funcionalmente identificado significativamente después de la clonación del gen, se describen en las secciones siguientes.
ALR1 y ALR2
Se aislaron dos genes, ALR1 y ALR2, en un cribado de tolerancia (resistencia) Al 3+ en levadura. [5] Se introdujeron construcciones de sobreexpresión que contenían ADN genómico de levadura en levadura de tipo salvaje y los transformantes se examinaron para determinar el crecimiento en niveles tóxicos de Al 3+ . Los plásmidos que contienen ALR1 y ALR2 permitieron el crecimiento de levadura en estas condiciones.
Las proteínas Alr1p y Alr2p constan de 859 y 858 aminoácidos respectivamente y son 70% idénticas. En una región del extremo C-terminal, la mitad de estas proteínas son débilmente similares a la proteína CorA completa. La topología de TM predicha por computadora de Alr1p se muestra en la figura. La presencia de un tercer dominio TM fue sugerida por MacDiarmid y Gardner (1998), [5] sobre la fuerza de la homología de secuencia, y más recientemente por Lee y Gardner (2006), [59] sobre la fuerza de los estudios de mutagénesis, lo que hace que la La topología TM de estas proteínas se parece más a la de CorA (ver figura). Además, Alr1p contiene el motivo GMN conservado en el extremo exterior de TM 2 (TM 2 ') y la mutación de la metionina (M) en este motivo a una leucina (L) condujo a la pérdida de capacidad de transporte. [59]
La figura muestra las dos posibles topologías de TM de Alr1p. La parte A de la figura muestra la topología de membrana predicha por computadora de la proteína Alr1p en levadura y la parte B muestra la topología de Alr1p basada en los resultados experimentales de Lee y Gardner (2006). [59] La ubicación del motivo GMN se indica en rojo y los dominios TM en azul claro. Se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los extremos N y C, los diversos tamaños de los dominios solubles se dan en aminoácidos (AA) y los dominios TM se numeran por su similitud con CorA. Cuando falta algún dominio de MT, los dominios restantes se numeran con números primos. La figura no está dibujada a escala. Un tercer gen similar a ALR está presente en S. cerevisiae y hay dos genes homólogos tanto en Schizosaccharomyces pombe como en Neurospora crassa . Estas proteínas contienen un motivo GMN como el de CorA, con la excepción del segundo gen de N. crassa . No se han identificado genes similares a ALR en especies fuera de los hongos.
Los estudios de fraccionamiento de membrana y de fusión de proteína verde fluorescente (GFP) establecieron que Alr1p se localiza en la membrana plasmática. [60] [61] Se observó que la localización de Alr1p se internaliza y degrada en la vacuola en respuesta a los cationes extracelulares. Mg 2+ , en concentraciones extracelulares muy bajas (100 μM; <10% del contenido de Mg 2+ del medio estándar ), y Co 2+ y Mn 2+ en concentraciones relativamente altas (> 20 × medio estándar), indujeron el cambio en Localización de la proteína Alr1p, y el efecto dependía de la ubiquitinación funcional, la endocitosis y la degradación vacuolar. [60] Este mecanismo se propuso para permitir la regulación de la absorción de Mg 2+ por la levadura. Sin embargo, un informe reciente [61] indica que varias de las observaciones realizadas por Stadler et al. [60] no fueron reproducibles. [61] Por ejemplo, no se observó la regulación de la acumulación de ARNm de ALR1 por el suministro de Mg 2+ , y la estabilidad de la proteína Alr1 no se redujo por la exposición a un exceso de Mg 2+ . Se replicó la observación original de la acumulación dependiente de Mg de la proteína Alr1 en condiciones de estado estacionario bajo en Mg, pero se demostró que este efecto es un artefacto causado por la adición de un pequeño péptido (epítopo) a la proteína para permitir su detección. . A pesar de estos problemas, se demostró que la actividad de Alr1 responde al suministro de Mg, [61] lo que sugiere que la actividad de la proteína está regulada directamente, como se observó para algunas proteínas CorA bacterianas. [19]
Se requiere un Alr1p funcional (tipo salvaje) o Alr2p (sobreexpresado) para el crecimiento de S. cerevisiae en condiciones estándar (Mg 2+ 4 mM [5] ), y Alr1p puede soportar un crecimiento normal a concentraciones de Mg 2+ tan bajas como 30 µM. [60] 57 Co 2+ se absorbe en la levadura a través de la proteína Alr1p con un km de 77 - 105 μM (; [56] C. MacDiarmid y RC Gardner, datos no publicados), pero la Ki para la inhibición de Mg 2+ de esta Actualmente se desconoce el transporte. El transporte de otros cationes por la proteína Alr1p se ensayó mediante la inhibición del crecimiento de levaduras. La sobreexpresión de Alr1p condujo a una mayor sensibilidad a Ca 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , La 3+ , Mn 2+ , Ni 2+ y Zn 2+ , una serie de cationes similares a los que se ha demostrado que se transportan a la levadura. por un sistema de transporte similar a CorA. [5] Se supone que el aumento de la toxicidad de los cationes en presencia del transportador se debe al aumento de la acumulación del catión dentro de la célula.
La evidencia de que Alr1p es principalmente un transportador de Mg 2+ es que la pérdida de Alr1p conduce a una disminución del contenido celular total de Mg 2+ , pero no de otros cationes. Además, dos estudios electrofisiológicos en los que se produjo Alr1p en ovocitos de levadura o de Xenopus mostraron una corriente dependiente de Mg 2+ en presencia de la proteína; [62] Salih y col. , en prep.
La cinética de la absorción de Mg 2+ por Alr1p se ha investigado mediante técnicas de electrofisiología en células de levadura completas. [62] Los resultados sugirieron que es muy probable que Alr1p actúe como un canal selectivo de iones. En el mismo artículo, los autores informaron que el transporte de Mg 2+ por Alr1p variaba de 200 pA a 1500 pA, con una corriente media de 264 pA. No se presentó una cuantificación de la cantidad de proteína que produce la corriente, por lo que los resultados carecen de comparabilidad con las proteínas de transporte bacterianas de Mg 2+ .
Las técnicas alternativas de análisis de radiotrazador de 28 Mg 2+ y mag-fura 2 para medir la absorción de Mg 2+ aún no se han utilizado con Alr1p. 28 Mg 2+ no está disponible actualmente y es poco probable que el sistema mag-fura 2 proporcione datos simples de absorción en la levadura. La célula de levadura mantiene una distribución heterogénea de Mg 2+ [63], lo que sugiere que múltiples sistemas dentro de la levadura transportan Mg 2+ a los compartimentos de almacenamiento. Es muy probable que este transporte interno enmascare el proceso de absorción. La expresión de ALR1 en S. typhimurium sin genes de captación de Mg 2+ puede ser una alternativa, pero, como se indicó anteriormente, deberían tenerse en cuenta los efectos de un sistema de expresión heterólogo.
MNR2
El gen MNR2 codifica una proteína estrechamente relacionada con las proteínas Alr, pero incluye características conservadas que definen un subgrupo distinto de proteínas CorA en genomas fúngicos, lo que sugiere un papel distinto en la homeostasis del Mg 2+ . Como un mutante alr1, el crecimiento de un mutante mnr2 era sensible a las condiciones deficientes en Mg 2+ , pero se observó que el mutante mnr2 acumulaba más Mg 2+ que una cepa de tipo salvaje en estas condiciones. [64] Estos fenotipos sugirieron que Mnr2 puede regular el almacenamiento de Mg 2+ dentro de un compartimento intracelular. De acuerdo con esta interpretación, la proteína Mnr2 se localizó en la membrana de la vacuola, un compartimento interno implicado en el almacenamiento del exceso de nutrientes minerales por la levadura. Un papel directo de Mnr2 en el transporte de Mg 2+ fue sugerido por la observación de que el aumento de la expresión de Mnr2, que redirigió parte de la proteína Mnr2 a la superficie celular, también suprimió el requisito de Mg 2+ de una cepa mutante doble alr1 alr2. La mutación mnr2 también alteró la acumulación de otros cationes divalentes, lo que sugiere que esta mutación puede aumentar la expresión del gen Alr o la actividad proteica. Un trabajo reciente [61] apoyó este modelo, mostrando que la actividad de Alr1 se incrementó en una cepa mutante mnr2, y que la mutación se asoció con la inducción de la actividad de Alr1 a una concentración externa de Mg más alta que la observada para una cepa de tipo salvaje Mnr2. Estos efectos se observaron sin ningún cambio en la acumulación de proteína Alr1, lo que nuevamente indica que la actividad de Alr1 puede regularse directamente por la concentración de Mg dentro de la célula.
MRS2 y Lpe10
Al igual que los genes ALR, el gen MRS2 se clonó y secuenció antes de que se identificara como un transportador de Mg 2+ . El gen MRS2 se identificó en el genoma nuclear de la levadura en una pantalla de supresores de una mutación de empalme de ARN del gen mitocondrial, [65] y fue clonado y secuenciado por Wiesenberger et al. (1992). [66] Mrs2p no se identificó como un transportador putativo de Mg 2+ hasta que Bui et al. (1999). [6] Gregan y col. (2001a) identificaron LPE10 por homología con MRS2 y mostraron que tanto los mutantes LPE10 como MRS2 alteraron el contenido de Mg 2+ de las mitocondrias de levadura y afectaron la actividad de corte y empalme de ARN en el orgánulo. [67] [68] Se ha demostrado que el transporte de Mg 2+ está mediado directamente por Mrs2p, [18] pero no por Lpe10p.
Las proteínas Mrs2p y Lpe10p tienen un tamaño de 470 y 413 residuos de aminoácidos, respectivamente, y una región de 250-300 aminoácidos en el medio de las proteínas muestra una similitud débil con la proteína CorA completa. Las topologías TM de las proteínas Mrs2p y Lpe10p se han evaluado utilizando un ensayo de protección de proteasa [6] [67] y se muestran en la figura. TM 1 y 2 corresponden a TM 2 y 3 en la proteína CorA. El motivo GMN conservado está en el extremo exterior del primer dominio TM, y cuando la glicina (G) en este motivo se mutó a una cisteína (C) en Mrs2p, el transporte de Mg 2+ se redujo fuertemente. [18]
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/0/04/MRS2_LPE10_topology.png)
La figura muestra la topología determinada experimentalmente de Mrs2p y Lpe10p adaptada de Bui et al. (1999) [6] y Gregan et al. (2001a). [67] La ubicación del motivo GMN se indica en rojo y los dominios TM en azul claro. Se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los extremos N y C terminales. Los diversos tamaños de los dominios solubles se dan en aminoácidos (AA), los dominios TM están numerados y la figura no está dibujada a escala.
Mrs2p se ha localizado en la membrana interna mitocondrial por fraccionamiento subcelular e inmunodetección [6] y Lpe10p en las mitocondrias. [67] Las mitocondrias que carecen de Mrs2p no muestran una captación rápida de Mg 2+ , solo una "fuga" lenta, y la sobreacumulación de Mrs2p conduce a un aumento en la tasa inicial de captación. [18] Además, CorA, cuando se fusiona con la secuencia líder mitocondrial de Mrs2p, puede complementar parcialmente el defecto mitocondrial conferido por la pérdida de Mrs2p o Lpe10p. Por tanto, Mrs2p y / o Lpe10p pueden ser el principal sistema de captación de Mg 2+ para las mitocondrias. Una posibilidad es que las proteínas formen heterodímeros, ya que ninguna de las proteínas (cuando se sobreexpresa) puede complementar completamente la pérdida de la otra. [67]
Las características de la captación de Mg 2+ en mitocondrias aisladas por Mrs2p se cuantificaron utilizando mag-fura 2. [18] La captación de Mg 2+ por Mrs2p compartió una serie de atributos con CorA. En primer lugar, la absorción de Mg 2+ dependía directamente del potencial eléctrico (ΔΨ) a través de la membrana límite. En segundo lugar, la captación está saturada muy por debajo de lo que permite teóricamente ΔΨ, por lo que es probable que el transporte de Mg 2+ por Mrs2p esté regulado de manera similar a CorA, posiblemente por la inactivación de la proteína. En tercer lugar, se observó un flujo de salida de Mg 2+ a través de Mrs2p tras la despolarización artificial de la membrana mitocondrial por valinomicina. Finalmente, los flujos de Mg 2+ a través de Mrs2p son inhibidos por cobalto (III) hexaamina. [18]
La cinética de la absorción de Mg 2+ por Mrs2p se determinó en Froschauer et al. (2004) artículo sobre CorA en bacterias. [19] El cambio inicial en la concentración de Mg 2+ libre fue 150 μM s-1 para el tipo salvaje y 750 μM s-1 para las mitocondrias de levadura que sobreexpresa MRS2. No se intentó escalar el transporte observado a la cantidad de transportador presente.
Protozoo ( Paramecium )
El transporte de Mg 2+ a Paramecium se ha caracterizado principalmente por RR Preston y sus colaboradores. Se utilizaron técnicas electrofisiológicas en todo el Paramecium para identificar y caracterizar las corrientes de Mg 2+ en una serie de artículos [69] [70] [71] [72] antes de que el gen fuera clonado por Haynes et al. (2002). [7]
El marco de lectura abierto para el gen XNTA tiene un tamaño de 1707 pb, contiene dos intrones y produce una proteína predicha de 550 aminoácidos. [7] La proteína se ha predicho para contener 11 dominios TM y también contiene la α1 y a2 motivos (véase la figura) de la SLC8 ( Na + / Ca 2+ intercambiador de [73] ) y SLC24 ( K + dependiente de Na + / Ca 2+ intercambiador [74] ) proteínas de transporte de solutos humanos. El XntAp es igualmente similar a las familias de proteínas SLC8 y SLC24 por secuencia de aminoácidos, pero la topología de TM predicha es más parecida a la de SLC24, pero la similitud es en el mejor de los casos débil y la relación es muy distante. [7] La proteína AtMHX de plantas también comparte una relación distante con las proteínas SLC8.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/6/60/XNTA_topology.png)
La figura muestra la topología TM predicha de XntAp. Adaptado de Haynes et al. (2002), [7] esta figura muestra la topología de membrana predicha por computadora de XntAp en Paramecium. La orientación en la membrana se determinó usando HMMTOP. [75] [76] Los dominios TM se muestran en azul claro, los dominios α1 y α2 se muestran en verde. Se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los terminales N y C y la figura no está dibujada a escala.
Las corrientes dependientes de Mg 2+ transportadas por XntAp son cinéticamente similares a las de una proteína de canal y tienen un orden de selectividad iónica de Mg 2+ > Co 2+ , Mn 2+ > Ca 2+ , una serie nuevamente muy similar a la de CorA . [72] A diferencia de las otras proteínas de transporte informadas hasta ahora, XntAp depende del Ca 2+ intracelular . El transporte también depende de ΔΨ, pero de nuevo el Mg 2+ no se transporta al equilibrio, estando limitado a aproximadamente 0,4 mM de Mg 2+ libre en el citoplasma. Los resultados respaldaron la existencia de un compartimento intracelular con una concentración libre mucho mayor de Mg 2+ (8 mM).
Animales
La investigación de Mg 2+ en animales, incluidos los seres humanos, se ha quedado atrás de la de bacterias y levaduras. Esto se debe en gran parte a la complejidad de los sistemas involucrados, pero también a la impresión dentro del campo de que el Mg 2+ se mantuvo en niveles altos en todas las células y no se modificó por influencias externas. Solo en los últimos 25 años ha comenzado una serie de informes a desafiar este punto de vista, con nuevas metodologías que encuentran que el contenido de Mg 2+ libre se mantiene en niveles donde los cambios podrían influir en el metabolismo celular. [77]
MRS2
Una búsqueda bioinformática de las bases de datos de secuencias identificó un homólogo del gen de levadura MRS2 en una variedad de metazoos. [8] La proteína tiene una secuencia muy similar y una topología TM predicha a la proteína de levadura, y el motivo GMN está intacto al final del primer dominio TM. La proteína humana, hsaMrs2p, se ha localizado en la membrana mitocondrial en células de ratón utilizando una proteína de fusión GFP.
Se sabe muy poco sobre las características de transporte de Mg 2+ de la proteína en mamíferos, pero Zsurka et al. (2001) ha demostrado que la Mrs2p humana complementa a los mutantes mrs2 en el sistema de captación de Mg 2+ mitocondrial de levadura . [8]
SLC41 (MgtE)
La identificación de esta familia de genes en los metazoos comenzó con un método de captura de secuencias de señales para aislar proteínas secretadas y de membrana. [9] Gran parte de la identificación proviene de análisis bioinformáticos. Finalmente, se identificaron tres genes en humanos, otros tres en ratón y tres en Caenorhabditis elegans , con un solo gen en Anopheles gambiae . La base de datos pFAM enumera el dominio MgtE como pFAM01769 y además identifica una proteína que contiene el dominio MgtE en Drosophila melanogaster . Las proteínas que contienen el dominio MgtE se pueden dividir en siete clases, según lo definido por pFAM utilizando el tipo y la organización de los dominios identificables en cada proteína. Las proteínas de los metazoos están presentes en tres de los siete grupos. Todas las proteínas de los metazoos contienen dos dominios MgtE, pero algunos de ellos se han predicho sólo mediante reconocimiento de contexto (Coin, Bateman y Durbin, no publicado. Consulte el sitio web de pFAM para obtener más detalles).
La proteína SLC41A1 humana contiene dos dominios MgtE con 52% y 46% de similitud respectiva con la secuencia consenso PF01769 y se predice que contiene diez dominios TM, cinco en cada dominio MgtE (ver figura), lo que sugiere que la proteína MgtE de bacterias puede funcionar como dímero.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/5/59/MGTE_Human.png)
Adaptado de Wabakken et al. (2003) [9] y la base de datos pFAM, la figura muestra la topología de membrana predicha por computadora de MgtE en H. sapiens . Los dominios TM se muestran en azul claro, se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los extremos N y C, y la figura no está dibujada a escala.
Wabakken y col. (2003) [9] encontraron que la transcripción del gen SLC41A1 se expresaba en todos los tejidos humanos analizados, pero a diferentes niveles, siendo el corazón y los testículos los que tenían la expresión más alta del gen. No se ha sugerido una explicación del patrón de expresión con respecto a la fisiología relacionada con el Mg 2+ .
No se ha demostrado si las proteínas SLC41 transportan Mg 2+ o complementan una mutación de transporte de Mg 2+ en ningún sistema experimental. Sin embargo, se ha sugerido que como las proteínas MgtE no tienen otra función conocida, es probable que sean transportadores de Mg 2+ en los metazoos como lo son en las bacterias. [9] Esto deberá verificarse utilizando uno de los sistemas experimentales ahora estándar para examinar el transporte de Mg 2+ .
TRPM6 / TRPM7
La investigación de los genes y proteínas TRPM en células humanas es un área de intenso estudio reciente y, en ocasiones, de debate. Montell y col. (2002) [78] han revisado la investigación sobre los genes TRP, y una segunda revisión de Montell (2003) [79] ha revisado la investigación sobre los genes TRPM.
La familia de canales iónicos TRPM tiene miembros en todos los metazoos. Las proteínas TRPM6 y TRPM7 son muy inusuales y contienen tanto un dominio de canal iónico como un dominio de quinasa (Figura 1.7), cuya función provoca el debate más acalorado. [79]
La actividad de estas dos proteínas ha sido muy difícil de cuantificar. TRPM7 por sí mismo parece ser un canal de Ca 2+ [80] pero en presencia de TRPM6 la serie de afinidad de cationes transportados coloca al Mg 2+ por encima del Ca 2+ . [10] [81] Las diferencias en la conductancia informadas fueron causadas por los patrones de expresión de estos genes. TRPM7 se expresa en todos los tipos de células probados hasta ahora, mientras que TRPM6 muestra un patrón de expresión más restringido. [82] Una desafortunada elección de sistema experimental por Voets et al. , (2004) [83] llevó a la conclusión de que TRPM6 es un transportador funcional de Mg 2+ . Sin embargo, el trabajo posterior de Chubanov et al. (2004) [82] mostró claramente que se requiere TRPM7 para la actividad de TRPM6 y que los resultados de Voets et al. se explican por la expresión de TRPM7 en la línea celular experimental utilizada por Voets et al. en sus experimentos. Aún no se ha determinado si TRPM6 es funcional por sí mismo.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/6/68/TRPM6-7_topology.png)
La topología TM predicha de las proteínas TPRM6 y TRPM7 se ha adaptado de Nadler et al. (2001), [10] Runnels et al. (2001) [84] y Montell et al. (2002), [78] esta figura muestra la topología de membrana predicha por computadora de las proteínas TRPM6 y TRPM7 en Homo sapiens . En este momento, la topología mostrada debe considerarse una hipótesis tentativa. Los dominios TM se muestran en azul claro, el bucle de poros en violeta, el motivo TRP en rojo y el dominio quinasa en verde. Se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los terminales N y C y la figura no está dibujada a escala.
Las conclusiones de Voets et al. (2004) [83] los artículos probablemente sean incorrectos al atribuir las corrientes dependientes de Mg 2+ solo a TRPM7, y es probable que sus datos cinéticos reflejen el canal TRPM7 / TRPM6 combinado. El informe presenta una colección robusta de datos consistentes con una actividad similar a un canal que pasa Mg 2+ , basada tanto en técnicas electrofisiológicas como en mag-fura 2 para determinar cambios en el Mg 2+ libre citoplásmico .
Transporte paracelular
Las claudinas permiten el transporte de Mg 2+ a través de la vía paracelular ; es decir, media el transporte del ión a través de las uniones estrechas entre las células que forman una capa de células epiteliales. En particular, Claudin-16 permite la recaptación selectiva de Mg 2+ en el riñón humano. Algunos pacientes con mutaciones en el gen CLDN19 también tienen transporte de magnesio alterado. [85] [86]
El gen Claudin-16 fue clonado por Simon et al. (1999), [12] pero solo después de una serie de informes que describieron el flujo de Mg 2+ en sí mismo sin genes ni proteínas. [87] [88] [89] El patrón de expresión del gen se determinó mediante RT-PCR y se demostró que está muy limitado a una región continua del túbulo renal que va desde la rama descendente gruesa medular hasta el túbulo contorneado distal . [12] Esta localización fue consistente con los informes anteriores sobre la ubicación de la recaptación de Mg 2+ por el riñón. Después de la clonación, se identificaron mutaciones en el gen en pacientes con hipomagnesemia familiar con hipercalciuria y nefrocalcinosis, [90] [91] fortaleciendo los vínculos entre el gen y la captación de Mg 2+ .
Plantas
El conocimiento actual de los mecanismos moleculares para el transporte de Mg 2+ en plantas es muy limitado, con solo tres publicaciones que informan una base molecular para el transporte de Mg 2+ en plantas. [13] [14] [15] Sin embargo, la importancia del Mg 2+ para las plantas ha sido bien descrita y los estudios fisiológicos y ecofisiológicos sobre los efectos del Mg 2+ son numerosos. Esta sección resumirá el conocimiento de una familia de genes identificada en plantas que está relacionada lejanamente con CorA. Otro gen, un intercambiador de Mg 2+ / H + (AtMHX [15] ), no relacionado con esta familia de genes y con CorA también ha sido identificado, está localizado en la membrana vacuolar y se describirá en último lugar.
La familia de genes AtMRS2
Schock y col. (2000) identificaron y nombraron la familia AtMRS2 basándose en la similitud de los genes con el gen MRS2 de la levadura. [13] Los autores también demostraron que el gen AtMRS2-1 podría complementar un fenotipo mutante de levadura Δmrs2. Independientemente, Li et al. (2001) [14] publicó un informe que identificaba a la familia y mostraba que dos miembros adicionales podrían complementar a los mutantes deficientes en el transporte de Mg 2+ , uno en S. typhimurium y el otro en S. cerevisiae .
Los tres genes que se ha demostrado que transportan Mg 2+ son AtMRS2-1, AtMRS2-10 y AtMRS2-11, y estos genes producen proteínas de 442, 443 y 459 aminoácidos de tamaño, respectivamente. Cada una de las proteínas muestra una similitud significativa con Mrs2p de levadura y una similitud débil con CorA de bacterias, contiene el motivo de aminoácidos GMN conservado en el extremo exterior del primer dominio TM y se predice que tiene dos dominios TM.
El gen AtMRS2-1, cuando se expresa en levadura a partir del promotor MRS2 y se fusiona en el extremo C con los primeros 95 aminoácidos de la proteína Mrs2p, se dirigió a las mitocondrias, donde se complementó fenotípicamente con un mutante Δmrs2 (el empalme de ARN mitocondrial fue restaurado) y con respecto al contenido de Mg 2+ del orgánulo. [13] No se presentaron datos sobre la cinética del transporte. El gen AtMRS2-11 se analizó en levadura (en la cepa alr1 alr2), donde se demostró que la expresión del gen aumentó significativamente la tasa de absorción de Mg 2+ en las células hambrientas sobre el control, medido mediante espectroscopia de absorción atómica de llama de contenido celular total de Mg 2+ . Sin embargo, se demostró que Alr1p es significativamente más eficaz para transportar Mg 2+ a concentraciones extracelulares bajas, lo que sugiere que la afinidad de AtMRS2-11 por Mg 2+ es menor que la de Alr1p. [14] Un análisis electrofisiológico (pinzamiento de voltaje) de la proteína AtMRS2-11 en ovocitos de Xenopus también mostró una corriente dependiente de Mg 2+ a potenciales de membrana (ΔΨ) de –100 - –150 mV en el interior. [92] Estos valores son fisiológicamente significativos, ya que varias membranas de las plantas mantienen ΔΨ en este rango. Sin embargo, el autor tuvo dificultades para reproducir estos resultados debido a una aparente "muerte" de los ovocitos que contienen la proteína AtMRS2-11 y, por lo tanto, estos resultados deben considerarse con precaución.
El transportador AtMRS2-10 se ha analizado mediante un análisis de captación de trazador radiactivo. Se utilizó [14] 63Ni 2+ como ión sustituto y se demostró que el Mg 2+ inhibe la captación de 63Ni 2+ con una Ki de 20 µM. La captación también fue inhibida por Co (III) Hex y por otros cationes divalentes. Sólo Co 2+ y Cu 2+ inhibieron el transporte con valores de Ki menores de 1 mM.
La proteína AtMRS2-10 se fusionó con GFP y se demostró que estaba localizada en la membrana plasmática. [14] Se intentó un experimento similar en Schock et al. (2000), [13] pero la localización observada no fue significativamente diferente de la observada con GFP sin fusionar. La razón más probable de la falta de una localización definitiva de AtMRS2-1 en Schock et al. El artículo es que los autores eliminaron los dominios TM de la proteína, impidiendo así su inserción en una membrana.
El significado fisiológico exacto de las proteínas AtMRS2-1 y AtMRS2-10 en plantas aún no se ha aclarado. El gen AtMRS2-11 se ha sobreexpresado (del promotor CaMV 35S) en A. thaliana. [92] Se ha demostrado que la línea transgénica acumula altos niveles de la transcripción AtMRS2-11. Se registró un fuerte fenotipo de deficiencia de Mg 2+ (manchas necróticas en las hojas, ver Capítulo 1.5 a continuación) durante el proceso de selección (en las generaciones T1 y T2) para una línea homocigota, pero este fenotipo se perdió en la generación T3 y podría no se reproducirá cuando las generaciones anteriores se examinen por segunda vez. El autor sugirió que los efectos ambientales eran la causa más probable del fenotipo inconsistente.
AtMHX
El primer transportador de magnesio aislado en cualquier organismo multicelular, AtMHX no muestra similitud con ninguna proteína de transporte de Mg 2+ previamente aislada . [15] El gen se identificó inicialmente en la base de datos de secuencias de ADN genómico de A. thaliana, por su similitud con la familia SLC8 de genes intercambiadores de Na + / Ca 2+ en humanos.
Se predice que la secuencia de ADNc de 1990 pb producirá una proteína de 539 aminoácidos. AtMHX está estrechamente relacionado con la familia SLC8 a nivel de aminoácidos y comparte una topología con once dominios TM predichos (Figura A10.5). Hay una diferencia importante en la secuencia, ya que el bucle no membranal largo (ver Figura A10.5) tiene 148 aminoácidos en la proteína AtMHX pero 500 aminoácidos en las proteínas SLC8. Sin embargo, este bucle no está bien conservado y no es necesario para la función de transporte en la familia SLC8. [15]
El gen AtMHX se expresa en toda la planta, pero con mayor fuerza en el tejido vascular. [15] Los autores sugieren que la función fisiológica de la proteína es almacenar Mg 2+ en estos tejidos para su posterior liberación cuando sea necesario. La localización de las proteínas en la membrana vacuolar apoya esta sugerencia (véase también el capítulo 1.5).
La proteína transporta Mg 2+ al espacio vacuolar y H + hacia fuera, como se demuestra mediante técnicas electrofisiológicas. [15] El transporte es impulsado por el ΔpH mantenido entre el espacio vacuolar (pH 4.5 - 5.9) y el citoplasma (pH 7.3 - 7.6) por una H + -ATPasa. [93] [94] No se determinó cómo se regula el transporte de Mg 2+ por la proteína. Se observó que las corrientes pasaban a través de la proteína en ambas direcciones, pero la corriente de salida de Mg 2+ requería un pH "citoplásmico" de 5,5, una condición que no se encuentra en las células vegetales en circunstancias normales. Además del transporte de Mg 2+ , Shaul et al. (1999) [15] también mostró que la proteína podría transportar Zn 2+ y Fe 2+ , pero no informó sobre la capacidad de la proteína para transportar otros cationes divalentes (por ejemplo, Co 2+ y Ni 2+ ) o su susceptibilidad a inhibición por cobalto (III) hexaamina.
No se ha determinado la cinética detallada del transporte de Mg 2+ para AtMHX. Sin embargo, se han demostrado efectos fisiológicos. Cuando las plantas de A. thaliana se transformaron con construcciones de sobreexpresión del gen AtMHX impulsado por el promotor CaMV 35S, las plantas acumularon en exceso la proteína y mostraron un fenotipo de lesiones necróticas en las hojas, que los autores sugieren que es causado por una interrupción en el función normal de la vacuola, dada su observación de que el contenido total de Mg 2+ (o Zn 2+ ) de las plantas no se alteró en las plantas transgénicas.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/en/b/b9/ATMHX_topology.png)
La imagen ha sido adaptada de Shaul et al. (1999) [15] y Quednau et al. (2004), [73] y combinado con un análisis usando HMMTOP, esta figura muestra la topología de membrana predicha por computadora de la proteína AtMHX en Arabidopsis thaliana . En este momento, la topología mostrada debe considerarse una hipótesis tentativa. Los dominios TM se muestran en azul claro, se indican la orientación en la membrana y las posiciones de los extremos N y C, y la figura no está dibujada a escala. Los dominios α1 y α2, que se muestran en verde, son ambos bastante hidrófobos y pueden insertarse en la membrana.
Referencias
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