Cromatografía de columna
La cromatografía en columna en química es un método de cromatografía utilizado para aislar un solo compuesto químico de una mezcla. La cromatografía es capaz de separar sustancias basándose en la adsorción diferencial de compuestos al adsorbente; los compuestos se mueven a través de la columna a diferentes velocidades, lo que les permite separarse en fracciones. La técnica es ampliamente aplicable, ya que se pueden utilizar muchos adsorbentes diferentes (fase normal, fase inversa o de otro tipo) con una amplia gama de disolventes. La técnica se puede utilizar en escalas desde microgramos hasta kilogramos. La principal ventaja de la cromatografía en columna es el costo relativamente bajo y la disponibilidad de la fase estacionaria.utilizado en el proceso. Este último evita la contaminación cruzada y la degradación de la fase estacionaria debido al reciclaje. La cromatografía en columna se puede realizar usando la gravedad para mover el solvente o usando gas comprimido para empujar el solvente a través de la columna.
Un cromatógrafo de capa fina puede mostrar cómo se comportará una mezcla de compuestos cuando se purifique mediante cromatografía en columna. La separación se optimiza primero mediante cromatografía en capa fina antes de realizar la cromatografía en columna.
Una columna se prepara empaquetando un absorbente sólido en un tubo cilíndrico de vidrio o plástico. El tamaño dependerá de la cantidad de compuesto que se aísle. La base del tubo contiene un filtro, ya sea un tapón de algodón o lana de vidrio, o una frita de vidrio para mantener la fase sólida en su lugar. Se puede conectar un depósito de disolvente en la parte superior de la columna.
Generalmente se utilizan dos métodos para preparar una columna: el método seco y el método húmedo. Para el método seco, la columna se llena primero con el polvo de la fase estacionaria seca, seguido de la adición de la fase móvil, que se lava a través de la columna hasta que esté completamente húmeda, y desde este punto nunca se permite que se seque. [1] Para el método húmedo, se prepara una suspensión del eluyente con el polvo de la fase estacionaria y luego se vierte cuidadosamente en la columna. La parte superior de la sílice debe ser plana y la parte superior de la sílice se puede proteger con una capa de arena. El eluyente se pasa lentamente a través de la columna para hacer avanzar el material orgánico.
Los componentes individuales son retenidos por la fase estacionaria de manera diferente y separados entre sí mientras circulan a diferentes velocidades a través de la columna con el eluyente. Al final de la columna eluyen de uno en uno. Durante todo el proceso de cromatografía, el eluyente se recoge en una serie de fracciones . Las fracciones se pueden recolectar automáticamente por medio de colectores de fracciones. La productividad de la cromatografía se puede aumentar ejecutando varias columnas a la vez. En este caso se utilizan colectores de flujo múltiple. La composición del flujo de eluyente se puede monitorear y cada fracción se analiza en busca de compuestos disueltos, por ejemplo, mediante cromatografía analítica, espectros de absorción UV o fluorescencia.. Los compuestos coloreados (o compuestos fluorescentes con la ayuda de una lámpara UV) se pueden ver a través de la pared de vidrio como bandas en movimiento.
La fase estacionaria o adsorbente en la cromatografía en columna es un sólido. La fase estacionaria más común para la cromatografía en columna es gel de sílice , la siguiente más común es la alúmina . El polvo de celulosa se ha utilizado a menudo en el pasado. Hay disponible una amplia gama de fases estacionarias para realizar cromatografía de intercambio iónico , cromatografía de fase inversa (RP), cromatografía de afinidad o adsorción en lecho expandido (EBA). Las fases estacionariasson generalmente polvos o geles finamente molidos y/o son microporosos para una mayor superficie, aunque en EBA se usa un lecho fluidizado. Existe una relación importante entre el peso de la fase estacionaria y el peso seco de la mezcla de analitos que se puede aplicar a la columna. Para la cromatografía en columna de sílice, esta relación se encuentra entre 20:1 y 100:1, dependiendo de qué tan cerca estén eluyendo los componentes del analito. [2]
