Etiqueta de extremo emparejado
Las etiquetas de extremos emparejados (PET) (a veces "diTags de extremos emparejados" o simplemente "ditags") son las secuencias cortas en los extremos 5' y 3' de un fragmento de ADN que son lo suficientemente únicas como para que (teóricamente) existan juntas solo una vez en un genoma , lo que hace que la secuencia de ADN entre ellos esté disponible en la búsqueda (si los datos de la secuencia del genoma completo están disponibles) o en la secuenciación adicional (ya que los sitios de etiquetas son lo suficientemente únicos como para servir como sitios de hibridación de cebadores ). Las etiquetas de extremos emparejados (PET) existen en las bibliotecas de PET con el ADN intermedio ausente, es decir, una PET "representa" un fragmento más grande de ADN genómico o cDNA .al constar de una secuencia enlazadora 5' corta, una etiqueta de secuencia 5' corta, una etiqueta de secuencia 3' corta y una secuencia enlazadora 3' corta. Se demostró conceptualmente que 13 pares de bases son suficientes para mapear etiquetas de forma única. [1] Sin embargo, las secuencias más largas son más prácticas para mapear lecturas de forma única. Las endonucleasas (discutidas a continuación) utilizadas para producir PET dan etiquetas más largas (18/20 pares de bases y 25/27 pares de bases), pero las secuencias de 50 a 100 pares de bases serían óptimas tanto para el mapeo como para la rentabilidad. [1] Después de extraer las PET de muchos fragmentos de ADN, se unen (concatenan) para lograr una secuenciación eficiente. En promedio, se pueden secuenciar de 20 a 30 etiquetas con el método Sanger , que tiene una longitud de lectura más larga.[1] Dado que las secuencias de etiquetas son cortas, las PET individuales son adecuadas para la secuenciación de próxima generación que tiene longitudes de lectura cortas y mayor rendimiento. Las principales ventajas de la secuenciación PET son su costo reducido al secuenciar solo fragmentos cortos, la detección de variantes estructurales en el genoma y una mayor especificidad cuando se alinea con el genoma en comparación con las etiquetas individuales, que involucran solo un extremo del fragmento de ADN.
El ADN genómico fragmentado o el ADN complementario (ADNc) de interés se clona en vectores plasmídicos . Los sitios de clonación están flanqueados por secuencias adaptadoras que contienen sitios de restricción para endonucleasas (discutido más adelante). Los insertos se ligan a los vectores de plásmido y los vectores individuales se transforman luego en E. coli para formar la biblioteca de PET. Las secuencias de PET se obtienen mediante la purificación del plásmido y la digestión con endonucleasa específica dejando dos secuencias cortas en los extremos de los vectores. En condiciones intramoleculares (diluidas), los vectores se vuelven a circular y se ligan, dejando solo los ditags en el vector. Las secuencias exclusivas del clon ahora están emparejadas. Dependiendo de la secuenciación de próxima generacióntécnica, las secuencias de PET se pueden dejar singulares, dimerizadas o concatenadas en cadenas largas. [1]
En lugar de la clonación, los adaptadores que contienen la secuencia de la endonucleasa se ligan a los extremos del ADN genómico o ADNc fragmentado. Luego, las moléculas se autocircularizan y se digieren con endonucleasa, liberando el PET. [1] Antes de la secuenciación, estos PET se ligan a adaptadores a los que se hibridan los cebadores de PCR para la amplificación. La ventaja de la construcción de la biblioteca basada en la clonación es que mantiene intactos los fragmentos o el ADNc para uso futuro. Sin embargo, el proceso de construcción es mucho más largo que el método sin clonación. Las empresas de secuenciación de próxima generación han producido variaciones en la construcción de bibliotecas para adaptarse a sus respectivas tecnologías. [1]
A diferencia de otras endonucleasas, las endonucleasas de restricción MmeI (tipo IIS) y EcoP15I (tipo III) cortan aguas abajo de sus sitios de unión objetivo. MmeI corta 18/20 pares de bases aguas abajo [2] y EcoP15I corta 25/27 pares de bases aguas abajo. [3] A medida que estas enzimas de restricción se unen a sus secuencias objetivo ubicadas en los adaptadores, cortan y liberan vectores que contienen secuencias cortas del fragmento o ADNc ligado a ellos, produciendo PET.
