Arildialquilfosfatasa
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Fosfotriesterasa
Identificadores
CE no.3.1.8.1
No CAS.117698-12-1
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MetaCyccamino metabólico
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Arildialquilfosfatasa ( EC 3.1.8.1 ) (más comúnmente conocido como fosfotriesterasa (PTE), y también organofosfato hidrolasa , paratión hidrolasa , paraoxón ase , y paratión arilo esterasa ) es una metaloenzima que hidroliza el enlace triéster [1] encuentra en organofosforados insecticidas .

Familia de la fosfotriesterasa
Estructura de la hidrolasa organofosforada.jpg
Estructura de la hidrolasa organofosforada
Identificadores
SímboloPTE
PfamPF02126
InterProIPR001559
PROSITEPDOC01026
SCOP21dpm / SCOPe / SUPFAM
Estructuras proteicas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
PDBRCSB PDB ; PDBe ; PDBj
PDBsumresumen de estructura
PDB1bf6 B: 2-292 1i0d B: 44-359 1i0b B: 44-359

1jgm A: 44-359 1ez2 A: 44-359 1dpm A: 44-359 1psc A: 44-359 1eyw A: 44-359 1hzy B: 44-359 1qw7 A: 44-359 1pta : 44-359 1p6c A: 44-359 1p6b A: 44-359 2d2h A: 43-358 2d2j A: 43-358

2d2g A: 43-358
un arilo dialquil fosfato + H 2 O dialquil fosfato + un alcohol arilo

Así, los dos sustratos de esta enzima son arildialquilfosfato y H 2 O , mientras que sus dos productos son dialquilfosfato y alcohol arílico .

El gen ( opd , para degradación de organofosforados) que codifica la enzima se encuentra en un plásmido grande (pSC1, 51Kb) endógeno de Pseudomonas diminuta , [2] aunque el gen también se ha encontrado en muchas otras especies bacterianas como Flavobacterium sp. . (ATCC27551), donde también está codificado en un elemento extracromosómico (pSM55, 43Kb). [2]

Organofosfato es el nombre general de los ésteres de ácido fosfórico y es uno de los compuestos organofosforados . Se pueden encontrar como parte de insecticidas , herbicidas y gases nerviosos , entre otros. Algunos organofosforados menos tóxicos se pueden utilizar como disolventes , plastificantes y aditivos EP . El uso de organofosforados representa aproximadamente el 38% de todo el uso de plaguicidas a nivel mundial. [3]

Gene

Se han identificado aislados bacterianos capaces de degradar plaguicidas organofosforados (OP) a partir de muestras de suelo de diferentes partes del mundo. [3] [4] La primera especie bacteriana que degrada los organofosforados se aisló de una muestra de suelo de Filipinas en 1973, [5] que se identificó como Flavobacterium sp. ATCC27551. Desde entonces, otras especies han demostrado tener capacidades de degradación de OP, como Pseudomonas diminuta (aislado de una muestra de suelo de EE. UU.), Agrobacterium radiobacter (aislado de una muestra de suelo de Australia), Alteromonas haloplanktis (aislado de una muestra de suelo de EE. UU.) Y Pseudomonas.sp. WBC-3 (aislado de una muestra de suelo chino). [3]

La capacidad de hidrolizar organofosforados no es exclusiva de las bacterias. Se ha descubierto que algunas especies de hongos y cianobacterias también hidrolizan los OP. [3] Además, mediante búsquedas de homología de secuencia de genomas completos, se identificaron varias otras especies bacterianas que también contienen secuencias de la misma familia de genes que opd , incluidas bacterias patógenas como Escherichia coli ( yhfV ) y Mycobacterium tuberculosis . [3]

La secuencia del gen que codifica la enzima ( opd ) en Flavobacterium sp. ATCC27551 y Pseudomonas diminuta están altamente conservadas (100% de homología de secuencia ), [4] aunque los plásmidos donde se encuentran los genes tienen secuencias muy diferentes aparte de una región conservada de 5,1 Kb [4] [6] donde se encuentra el gen. [2]

Una mirada más cercana a la organización del gen opd de Flavobacterium sugiere una posible arquitectura similar a un transposón , que explica la distribución generalizada del gen entre otras especies microbianas que podrían haber ocurrido a través de la transferencia lateral de ADN. El gen opd está flanqueado por secuencias de inserción de transposición, características de la familia de transposones Tn3 . Además, una secuencia similar a la transposasa (homóloga a TnpA ) y una secuencia similar a la resolvasa (homóloga a TnpR ) también se identificaron en regiones aguas arriba del gen opd , [4]que son características de transposones de clase II como Tn3.

Además, se identificó otro marco de lectura abierto aguas abajo de opd y codifica una proteína que degrada aún más el p-nitrofenol , uno de los subproductos de la degradación de OP. Se cree que esta proteína funciona como un complejo con PTE, ya que se observa un aumento dramático en la actividad cuando está presente PTE. [4]

Por lo tanto, la organización arquitectónica característica de la región del gen opd sugiere que diferentes especies adquirieron el gen a través de la transferencia horizontal a través de la transposición y la transferencia de plásmidos.

Proteína

Estructura

La fosfotriesterasa (PTE) pertenece a una familia de metaloenzimas que tiene dos átomos de metal Zn 2+ catalíticos , unidos mediante un ligando común y coordinados por cadenas laterales de imidazol de residuos de histidina que se agrupan alrededor de los átomos de metal. [7] La proteína forma un homodímero. [8] La estructura general consiste en un motivo de barril α / β, también presente en otras 20 proteínas catalíticas. Los sitios activos de estas proteínas se encuentran en la parte C-terminal del barril β, que es donde también se encuentra el sitio activo de la PTE. [7]

Esquema de reacción de la hidrólisis catalizada por enzimas de paraoxon en ácido dietilfosfórico y p-nitrofenol.

Catálisis

La catálisis de los organofosforados se produce mediante una sustitución nucleofílica con inversión de la configuración ( mecanismo S N 2 ) alrededor del centro de fósforo del sustrato. [7] En el sitio activo, los cationes metálicos ayudan en la catálisis polarizando aún más el enlace P – O del sustrato, lo que lo hace más susceptible a un ataque nucleofílico. Además, un residuo básico extrae un protón de una molécula de agua, y el ión hidróxido producido une los dos cationes divalentes y actúa como nucleófilo. El OH - luego ataca el centro de fósforo del sustrato, seguido de un evento de transferencia de protones. El enlace P – O se rompe y los productos se liberan del sitio activo. [9] La tasa de rotación ( kcat ) de fosfotriesterasa es casi 10 4 s −1 para la hidrólisis de paraoxon, [10] y los productos son p-nitrofenol y ácido dietilfosfórico .

Cinética

El modelo cinético propuesto consiste en un paso de unión reversible que tiene lugar entre la enzima y el sustrato, y la formación del complejo de Michaelis (ES). Sigue un paso irreversible, cuando el enlace P – O se escinde y se forma el complejo transitorio enzima + producto (EP). Por último, se liberan los productos y se regenera la enzima libre (E). [9]

Especies

La fosfotriesterasa está presente en dos especies, Pseudomonas diminuta y Flavobacterium sp. ATCC27551. Otras variantes de genes que también codifican enzimas degradantes de organofosforados están presentes en otras especies. La lista incluye especies bacterianas como Deinococcus radiodurans , patógenos Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis , la bacteria anaerobia Desulfatibacillum alkenivorans , la bacteria termofílica Geobacillus sp. y Thermoanaerobacter sp. X514, Escherichia coli ( yhfV ) y muchos otros grupos de bacterias, [3] y también algunosArchaea como Sulfolobus acidocaldarius . [11]

Diagrama esquemático de la pared celular de bacterias Gram-negativas (Pseudomonas) que muestra la membrana interna donde se ancla la PTE y el espacio periplásmico.

Localización subcelular

La fosfotriesterasa es una proteína asociada a la membrana que se traduce con un péptido diana de 29 aminoácidos de longitud (motivo Tat), [12] [10] [13] que luego se escinde de la proteína madura después de la inserción en la membrana plasmática. [1] La proteína está anclada a la membrana interna de la célula, de cara al periplasma. [14]

Función

La enzima fosfotriesterasa hidroliza los compuestos organofosforados al escindir el enlace triéster en el sustrato.

Compuestos organofosforados que sirven como sustratos para la hidrólisis catalizada por enzimas por PTE.

La enzima tiene una especificidad de sustrato muy amplia, [12] y es muy eficiente en catalizar la reacción: PTE hidroliza paraoxon a una velocidad cercana al límite de difusión, [15] lo que indica que la enzima evoluciona de manera óptima para usar este sustrato. [13] Se actúa específicamente sobre triésteres organofosfatos sintéticos y phosphorofluoridates . [3] No parece tener un sustrato natural y, por lo tanto, puede haber evolucionado de manera óptima para utilizar paraoxón y otros pesticidas agrícolas comunes. [15]

Los productos de la reacción son ácido dietilfosfórico y p-nitrofenol. [4] El último producto se degrada aún más por una enzima codificada de 750 pb aguas abajo del gen opd , y codifica una supuesta hidrolasa de 29 kDa que puede estar involucrada en la degradación de compuestos aromáticos y trabaja en conjunto con PTE. [4] Esta enzima es homóloga a las hidrolasas en Pseudomonas putida , Pseudomonas azelaica , Rhodococcus sp. Y P. fluorescens . [4]

Los organofosforados no son tóxicos para las bacterias, pero actúan como inhibidores de la acetilcolinesterasa en animales. [16] Algunas especies de bacterias también pueden utilizar organofosforados como fuente de nutrientes y carbono. [14]

Importancia ambiental

Las fosfotriesterasas se consideran un potente biocatalizador candidato para fines de biorremediación. [7] Su amplia especificidad de sustrato y eficiencia catalítica lo convierte en un objetivo atractivo para el uso potencial de microbios que contienen el gen opd en suelos desintoxicantes que son tóxicos debido al uso excesivo de pesticidas. [3] Además, los organofosforados actúan como inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE). El neurotransmisor AChE es un componente vital del sistema nervioso central (SNC) en los insectos de los animales, y la inhibición del recambio adecuado de este neuroquímico da como resultado una sobreestimulación del SNC, que finalmente da como resultado la muerte de insectos y mamíferos. [3] [17]Como resultado, el uso de microorganismos que degradan los organofosforados es un método potencialmente eficaz, de bajo costo y respetuoso con el medio ambiente para eliminar estos compuestos tóxicos del medio ambiente. [3]

Historia

Se han aislado especies bacterianas que tenían la capacidad de degradar plaguicidas organofosforados de muestras de suelo de diferentes partes del mundo. La primera cepa bacteriana identificada capaz de hidrolizar organofosforados fue Flavobacterium sp. ATCC 27551, encontrado por Sethunathan y Yoshida en 1973 a partir de una muestra de suelo originaria de Filipinas. [5] Desde entonces, se descubrió que otras especies también tienen enzimas degradantes de organofosforados similares a las que se encuentran en Flavobacterium [6] .

Referencias

  1. ↑ a b Pinjari AB, Pandey JP, Kamireddy S, Siddavattam D (julio de 2013). "Expresión y localización subcelular de la hidrolasa organofosforada en la cepa Ind01 de Pseudomonas sp. Degradantes de acefato y su uso como potencial biocatalizador para la eliminación de insecticidas organofosforados" . Cartas en Microbiología Aplicada . 57 (1): 63–8. doi : 10.1111 / lam.12080 . PMID  23574004 . S2CID  12006833 .
  2. ↑ a b c Harper LL, McDaniel CS, Miller CE, Wild JR (octubre de 1988). "Plásmidos diferentes aislados de Pseudomonas diminuta MG y Flavobacterium sp. (ATCC 27551) contienen genes opd idénticos" . Microbiología aplicada y ambiental . 54 (10): 2586–9. Código bibliográfico : 1988ApEnM..54.2586H . doi : 10.1128 / AEM.54.10.2586-2589.1988 . PMC 204325 . PMID 3202637 .  
  3. ^ a b c d e f g h i j Singh BK (febrero de 2009). "Bacterias degradantes de organofosforados: ecología y aplicaciones industriales". Reseñas de la naturaleza. Microbiología . 7 (2): 156–64. doi : 10.1038 / nrmicro2050 . PMID 19098922 . S2CID 205497513 .  
  4. ↑ a b c d e f g h Siddavattam D, Khajamohiddin S, Manavathi B, Pakala SB, Merrick M (mayo de 2003). "Organización similar a un transposón del grupo de genes de degradación de organofosfato (opd) transmitido por plásmido que se encuentra en Flavobacterium sp" . Microbiología aplicada y ambiental . 69 (5): 2533–9. Código Bibliográfico : 2003ApEnM..69.2533S . doi : 10.1128 / AEM.69.5.2533-2539.2003 . PMC 154515 . PMID 12732518 .  
  5. ↑ a b Sethunathan N, Yoshida T (julio de 1973). "Una Flavobacterium sp. Que degrada el diazinón y el paratión". Revista Canadiense de Microbiología . 19 (7): 873–5. doi : 10.1139 / m73-138 . PMID 4727806 . 
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Otras lecturas

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  • Bosmann HB (julio de 1972). "Enzimas marcadoras de membrana. Caracterización de una arilesterasa de la corteza cerebral de cobaya utilizando acetato de p-nitrofenilo como sustrato". Biochimica et Biophysica Acta . 276 (1): 180–91. doi : 10.1016 / 0005-2744 (72) 90019-8 . PMID  5047702 .
  • Mackness MI, Thompson HM, Hardy AR, Walker CH (julio de 1987). "Distinción entre 'A'-esterasas y arilesterasas. Implicaciones para la clasificación de esterasas" . La revista bioquímica . 245 (1): 293–6. doi : 10.1042 / bj2450293 . PMC  1148115 . PMID  2822017 .
  • AR principal (1960). "La diferenciación de las esterasas tipo A en suero de oveja" . Biochem. J . 75 : 188-195. doi : 10.1042 / bj0750188 . PMC  1204348 . PMID  14420012 .
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