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La microscopía de localización fotoactivada ( PALM o FPALM ) [1] [2] y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) [3] son métodos de imágenes de microscopía de fluorescencia de campo amplio (a diferencia de las técnicas de escaneo puntual como la microscopía confocal de escaneo láser ) que permiten obtener imágenes con una resolución superior al límite de difracción . Los métodos se propusieron en 2006 a raíz de la aparición generalizada de métodos de microscopía óptica de superresolución, y la revista Nature Methods los incluyó como Métodos del año en 2008 . [4]El desarrollo de PALM como un método de imágenes biofísicas dirigido fue impulsado en gran medida por el descubrimiento de nuevas especies y la ingeniería de mutantes de proteínas fluorescentes que muestran un fotocromismo controlable , como GFP fotoactivable . Sin embargo, el desarrollo concomitante de STORM, que comparte el mismo principio fundamental, originalmente hizo uso de colorantes de cianina emparejados . Una molécula del par (llamada activador), cuando se excita cerca de su máximo de absorción, sirve para reactivar la otra molécula (llamada informadora) al estado fluorescente.

Se utiliza un número creciente de tintes para PALM, STORM y técnicas relacionadas, tanto fluoróforos orgánicos como proteínas fluorescentes. Algunos son compatibles con imágenes de células vivas, otros permiten una adquisición más rápida o un etiquetado más denso. La elección de un fluoróforo particular depende en última instancia de la aplicación y de sus propiedades fotofísicas subyacentes. [5]

Ambas técnicas han experimentado importantes desarrollos técnicos, [6] en particular permitiendo la obtención de imágenes multicolores y la extensión a tres dimensiones, con la mejor resolución axial actual de 10 nm en la tercera dimensión obtenida mediante un enfoque interferométrico con dos objetivos opuestos que recogen la fluorescencia de la muestra. [7]

Principio [ editar ]

Representación esquemática de la reconstrucción de una imagen de alta resolución localizando el centroide de muchas imágenes de baja resolución de emisores de luz puntuales

La microscopía de fluorescencia convencional se realiza mediante la tinción selectiva de la muestra con moléculas fluorescentes , ya sea unidas a anticuerpos como en inmunohistoquímica o utilizando proteínas fluorescentes fusionadas genéticamente a los genes de interés. Normalmente, cuanto más concentrados estén los fluoróforos, mejor será el contraste de la imagen de fluorescencia.

Se puede visualizar un solo fluoróforo bajo un microscopio (o incluso a simple vista [8] ) si el número de fotones emitidos es lo suficientemente alto y, por el contrario, el fondo es lo suficientemente bajo. La imagen bidimensional de una fuente puntual observada bajo un microscopio es un punto extendido, correspondiente al disco de Airy (una sección de la función de dispersión puntual ) del sistema de imágenes. La capacidad de identificar como dos entidades individuales dos fluoróforos estrechamente espaciados está limitada por la difracción de la luz. Esto se cuantifica con el criterio de Abbe , afirmando que la distancia mínima que permite resolver dos fuentes puntuales viene dada por

donde es la longitud de onda de la emisión fluorescente y NA es la apertura numérica del microscopio. El límite de resolución teórico a la longitud de onda de excitación práctica más corta es de alrededor de 150 nm en la dimensión lateral y se acerca a 400 nm en la dimensión axial (si se usa un objetivo que tiene una apertura numérica de 1,40 y la longitud de onda de excitación es de 400 nm).

Sin embargo, si la emisión de las dos moléculas fluorescentes vecinas se hace distinguible, es decir, se pueden identificar los fotones procedentes de cada una de las dos, entonces es posible superar el límite de difracción. [9] Una vez que se recolecta un conjunto de fotones de una molécula específica, se forma un punto limitado por difracción en el plano de la imagen del microscopio. El centro de este punto se puede encontrar ajustando el perfil de emisión observado a una función geométrica conocida, típicamente una gaussiana.función en dos dimensiones. El error que se comete al localizar el centro de un emisor puntual escala a una primera aproximación como la raíz cuadrada inversa del número de fotones emitidos, y si se recolectan suficientes fotones, es fácil obtener un error de localización mucho menor que el punto original. función de propagación.

Múltiples emisores estrechamente espaciados son indistinguibles. La posición de una fuente puntual se puede recuperar solo si los fotones que emitió se han identificado a partir de los que surgen de las moléculas vecinas.

Los dos pasos de identificación y localización de moléculas fluorescentes individuales en un ambiente denso donde muchas están presentes son la base de PALM, STORM y su desarrollo.

Aunque existen muchos enfoques para la identificación molecular, el fotocromismo inducido por la luz de fluoróforos seleccionados se desarrolló como el enfoque más prometedor para distinguir moléculas vecinas separando su emisión fluorescente en el tiempo. Al encender subconjuntos estocásticamente escasos de fluoróforos con luz de una longitud de onda específica, las moléculas individuales se pueden excitar y obtener imágenes de acuerdo con sus espectros. Para evitar la acumulación de fluoróforos activos en la muestra, que eventualmente se degradarían de nuevo a una imagen de difracción limitada, el fenómeno de fotoblanqueo que ocurre espontáneamente se explota en PALM, mientras que el cambio reversible entre un estado encendido fluorescente y un estado apagado oscuro de se explota un tinte en STORM.

Fotoactivación, localización y blanqueo

En resumen, PALM y STORM se basan en recolectar bajo un microscopio fluorescente una gran cantidad de imágenes, cada una de las cuales contiene solo unos pocos fluoróforos activos aislados. La secuencia de imágenes permite los muchos ciclos de emisión necesarios para activar estocásticamente cada fluoróforo desde un estado no emisivo (o menos emisivo) a un estado brillante, y de regreso a un estado no emisivo o blanqueado. Durante cada ciclo, la densidad de las moléculas activadas se mantiene lo suficientemente baja como para que las imágenes moleculares de los fluoróforos individuales no se solapen normalmente.

Marco CCD único que muestra proteínas fluorescentes individuales excitadas en Reflexión Interna Total
Secuencia de fotogramas que contienen imágenes de una sola molécula

Localización de fluoróforos individuales [ editar ]

En cada imagen de la secuencia, la posición de un fluoróforo se calcula con una precisión típicamente mayor que el límite de difracción - en el rango típico de unos pocos a decenas de nm - y la información resultante de la posición de los centros de todos los puntos localizados. moléculas se utilizan para construir la imagen PALM o STORM de superresolución.

La precisión de localización se puede calcular de acuerdo con la fórmula:

donde N es el número de fotones recolectados, a es el tamaño de píxel del detector de imágenes, es la señal de fondo promedio y es la desviación estándar de la función de dispersión de puntos. [10] El requisito de localizar al mismo tiempo múltiples fluoróforos simultáneamente en un área extendida determina la razón por la cual estos métodos son de campo amplio, empleando como detector una cámara CCD , EMCCD o CMOS .

El requisito de una relación señal / ruido mejorada para maximizar la precisión de la localización determina la combinación frecuente de este concepto con microscopios fluorescentes de campo amplio que permiten el corte óptico, como los microscopios de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y los microscopios de fluorescencia de hoja de luz .

La imagen de superresolución [ editar ]

La resolución de la imagen final está limitada por la precisión de cada localización y el número de localizaciones, en lugar de por difracción. La imagen de superresolución es, por tanto, una representación puntillista de las coordenadas de todas las moléculas localizadas. La imagen de súper resolución se representa comúnmente representando cada molécula en el plano de la imagen como un gaussiano bidimensional con amplitud proporcional al número de fotones recolectados y la desviación estándar dependiendo de la precisión de localización.

Autoorganización de la red de quimiotaxis de escherichia coli obtenida con microscopía de luz de superresolución. La barra de escala en (A – E) indica 1 µm. La barra de escala en (F – H) indica 50 nm. [11]

Aplicaciones [ editar ]

PALMA / TORMENTA multicolor [ editar ]

Estrategias para microscopía de localización multicolor. Izquierda: separación espectral. Centro: múltiples activadores (STORM). Derecha: imagen radiométrica

Las peculiares propiedades fotofísicas de los fluoróforos empleados en las imágenes de súper resolución PALM / STORM plantean tanto limitaciones como oportunidades para las imágenes multicolores. Hasta ahora han surgido tres estrategias: excitación de fluoróforos separados espectralmente usando un divisor de haz de emisión, [12] usando múltiples activadores / reporteros en modo STORM [13] [14] e imágenes radiométricas de fluoróforos espectralmente cercanos. [15]

3D en PALM y STORM [ editar ]

Aunque originalmente se desarrollaron como métodos de imágenes 2D (x, y), PALM y STORM se han convertido rápidamente en técnicas capaces de 3D (x, y, z). Para determinar la posición axial de un solo fluoróforo en la muestra, actualmente se utilizan los siguientes enfoques: modificación de la función de dispersión de puntos para introducir características dependientes de z en la imagen 2D (x, y) (el enfoque más común es introducir astigmatismo en el PSF); detección multiplano , donde la posición axial se determina comparando dos imágenes del mismo PSF desenfocadas una con respecto a la otra; determinación interferométrica de la posición axial del emisor usando dos objetivos opuestos y múltiples detectores; [7] uso del enfoque temporalpara limitar la excitación / activación; uso de la excitación / activación de la hoja de luz para limitar a unos pocos cientos de nanómetros de capa de espesor colocada arbitrariamente a lo largo del plano z dentro de la muestra.

Imágenes de células vivas [ editar ]

El requisito de múltiples ciclos de activación, excitación y desactivación / blanqueo implicaría típicamente períodos de tiempo prolongados para formar una imagen PALM / STORM y, por lo tanto, la operación en una muestra fija. Ya en 2007 se han publicado varios trabajos [16] que interpretan PALM / STORM en células vivas. La capacidad de realizar imágenes de superresolución en vivo utilizando estas técnicas depende en última instancia de las limitaciones técnicas de recolectar suficientes fotones de un solo emisor en muy poco tiempo. Esto depende tanto de las limitaciones fotofísicas de la sonda como de la sensibilidad del detector empleado. Los procesos relativamente lentos (segundos a decenas de segundos) como la modificación en la organización de las adherencias focales se han investigado mediante PALM, [17]mientras que STORM ha permitido obtener imágenes de procesos más rápidos como la difusión de membranas de fosas recubiertas de clatrina o procesos de fusión / fisión mitocondrial. Una aplicación prometedora de PALM de células vivas es el uso de la fotoactivación para realizar un seguimiento de una sola partícula de alta densidad (sptPALM [18] ), superando la limitación tradicional del seguimiento de una sola partícula para trabajar con sistemas que muestran una concentración muy baja de fluoróforos.

Interacciones nanofotónicas [ editar ]

Si bien las mediciones tradicionales de PALM y STORM se utilizan para determinar la estructura física de una muestra, y las intensidades de los eventos fluorescentes determinan la certeza de la localización, estas intensidades también se pueden utilizar para mapear interacciones de fluoróforos con estructuras nanofotónicas . Esto se ha realizado tanto en estructuras metálicas ( plasmónicas ), como nanobarras de oro, [19] [20] como en estructuras semiconductoras, como nanocables de silicio. [21]Estos enfoques pueden usarse para fluoróforos funcionalizados en la superficie de la muestra de interés (como para los estudios de partículas plasmónicas mencionados aquí), o adsorberse aleatoriamente en el sustrato que rodea la muestra, lo que permite un mapeo 2D completo de interacciones fluoróforo-nanoestructura en todas las posiciones. relativo a la estructura. [21]

Estos estudios han encontrado que, además de la incertidumbre estándar de localización debido al ajuste de la función de dispersión de puntos , la autointerferencia con la luz dispersada por nanopartículas puede conducir a distorsiones o desplazamientos de las funciones de dispersión de puntos de la imagen, [20] [21] complicando el análisis de tales medidas. Sin embargo, es posible limitarlos, por ejemplo, incorporando máscaras de metasuperficie que controlan la distribución angular de la luz permitida en el sistema de medición. [22]

Diferencias entre PALM y STORM [ editar ]

PALM y STORM comparten un principio fundamental común, y numerosos desarrollos han tendido a hacer que las dos técnicas estén aún más entrelazadas. Aún así, se diferencian en varios detalles técnicos y un punto fundamental. En el aspecto técnico, PALM se realiza en una muestra biológica utilizando fluoróforos expresados ​​exógenamente en forma de construcciones de fusión genética a una proteína fluorescente fotoactivable. STORM, en cambio, utiliza el inmunomarcaje de moléculas endógenas en la muestra con anticuerpos marcados con fluoróforos orgánicos. En ambos casos, los fluoróforos son impulsados ​​por la luz entre un estado activo-ENCENDIDO y un estado inactivo-APAGADO. En PALM, sin embargo, la fotoactivación y el fotoblanqueo limitan la vida del fluoróforo a un intervalo de tiempo limitado, y es deseable una emisión continua del fluoróforo en el medio sin ninguna intermitencia de fluorescencia.En STORM estocásticoEl fotoparpadeo de los fluoróforos orgánicos (típicamente más brillantes que las proteínas fluorescentes) se explotó originalmente para separar los tintes vecinos. A este respecto, cuanto más robusto sea el parpadeo, mayor será la probabilidad de distinguir dos fluoróforos vecinos.

En este sentido, varios trabajos de investigación han explorado el potencial de PALM para realizar una cuantificación del número de fluoróforos (y por tanto de proteínas de interés) presentes en una muestra contando los fluoróforos activados. [11] [23] [24] El enfoque utilizado para tratar la dinámica fluorescente de la etiqueta fluorescente utilizada en los experimentos determinará la apariencia final de la imagen de superresolución y la posibilidad de determinar una correspondencia inequívoca entre un evento de localización y una proteína en la muestra.

Multimedia [ editar ]

  • Reproducir medios

    Proteínas fluorescentes inmovilizadas fotoactivadas, excitadas y blanqueadas

  • Reproducir medios

    Imágenes dinámicas de súper resolución de espinas dendríticas utilizando una actina fotoconvertible de baja afinidad. [25]

  • Reproducir medios

    Investigación de la dinámica de la actina sub-espinal en las neuronas del hipocampo de rata con microscopía óptica de superresolución [26]

Referencias [ editar ]

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Enlaces externos [ editar ]

  • Microscopía de superresolución dentro de la página educativa de Zeiss en microscopía e imágenes digitales
  • Conceptos fundamentales en súper resolución dentro de los recursos educativos de Nikon para la educación en microscopía
  • Eric Betzig y Harald Hess hablan: Desarrollo de la microscopía PALM
  • Charla de Xiaowei Zhuang: Microscopía de súper resolución
  • Microscopía óptica: una revolución contemporánea en curso (Revisión introductoria)