Perfilado de polisomas
El perfilado de polisomas es una técnica de biología molecular que se utiliza para estudiar la asociación de ARNm con ribosomas . Es importante tener en cuenta que esta técnica es diferente del perfilado de ribosomas . Ambas técnicas han sido revisadas [1] y ambas se utilizan en el análisis del traductor , pero los datos que generan se encuentran en niveles muy diferentes de especificidad. Cuando la emplean expertos, la técnica es notablemente reproducible: los 3 perfiles en la primera imagen son de 3 experimentos diferentes. [2]
El procedimiento comienza haciendo un lisado celular de las células de interés. Este lisado contiene polisomas , monosomas (compuestos por un ribosoma que reside en un ARNm ), las subunidades ribosómicas pequeñas (40S en eucariotas ) y grandes (60S en eucariotas), ARNm "libre" y una serie de otros componentes celulares solubles .
El procedimiento continúa haciendo un gradiente continuo de sacarosa de densidad continuamente variable en un tubo de centrífuga . A las concentraciones utilizadas (15-45 % en el ejemplo), la sacarosa no altera la asociación de los ribosomas y el ARNm. La porción del 15 % del gradiente está en la parte superior del tubo, mientras que la porción del 45 % está en la parte inferior debido a su diferente densidad .
Luego, una cantidad específica (medida por la densidad óptica ) del lisado se coloca suavemente sobre el gradiente en el tubo. El lisado, aunque contiene una gran cantidad de material soluble, es mucho menos denso que el 15% de sacarosa, por lo que puede mantenerse como una capa separada en la parte superior del tubo si se hace con cuidado.
Para separar los componentes del lisado, la preparación se somete a centrifugación. Esto acelera los componentes del lisado con muchas veces la fuerza de la gravedad y, por lo tanto, los impulsa a través del gradiente en función de cuán "grandes" sean los componentes individuales. Las subunidades pequeñas (40S) se adentran menos en el gradiente que las subunidades grandes (60S). Los ribosomas 80S en un ARNm viajan más lejos (tenga en cuenta que la contribución del tamaño del ARNm a la distancia recorrida no es significativa). Los polisomas compuestos por 2 ribosomas viajan más lejos, los polisomas con 3 ribosomas viajan aún más lejos, y así sucesivamente. El "tamaño" de los componentes se designa por S, la unidad Svedberg . Tenga en cuenta que uno S = 10 −13 segundos, y que el concepto de "grande" es en realidad una simplificación excesiva.
Después de la centrifugación, el contenido del tubo se recoge como fracciones desde la parte superior (recorrido más pequeño y lento) hasta la parte inferior (recorrido más grande y rápido) y se determina la densidad óptica de las fracciones. Las primeras fracciones eliminadas tienen una gran cantidad de moléculas relativamente pequeñas, como ARNt, proteínas individuales, etc.
