El perfil de ribosoma , o Ribo-Seq (también llamado huella de ribosoma ), es una adaptación de una técnica desarrollada por Joan Steitz y Marilyn Kozak hace casi 50 años que Nicholas Ingolia y Jonathan Weissman adaptaron para trabajar con la secuenciación de próxima generación que utiliza ARN mensajero especializado ( secuenciación de ARNm ) para determinar qué ARNm se están traduciendo activamente . [1] [2]Una técnica relacionada que también se puede utilizar para determinar qué ARNm se están traduciendo activamente es la metodología de purificación por afinidad del ribosoma de traducción (TRAP), que fue desarrollada por Nathaniel Heintz en la Universidad Rockefeller (en colaboración con Paul Greengard y Myriam Heiman). [3] [2] TRAP no implica la huella de ribosoma, pero proporciona información específica del tipo de célula.
Descripción
Produce una “instantánea global” de todos los ribosomas que se traducen activamente en una célula en un momento particular, lo que se conoce como translatome . En consecuencia, esto permite a los investigadores identificar la ubicación de los sitios de inicio de la traducción , el complemento de los ORF traducidos en una célula o tejido, la distribución de los ribosomas en un ARN mensajero y la velocidad de traducción de los ribosomas. [4] El perfil del ribosoma se dirige solo a las secuencias de ARNm protegidas por el ribosoma durante el proceso de decodificación por traducción, a diferencia del ARN-Seq , que secuencia todo el ARNm de una secuencia dada presente en una muestra. [1] Esta técnica también es diferente de la elaboración de perfiles de polisomas .
Historia
El perfil de ribosomas se basa en el descubrimiento de que el ARNm dentro de un ribosoma puede aislarse mediante el uso de nucleasas que degradan las regiones de ARNm no protegidas. Esta técnica analiza las regiones de ARNm que se convierten en proteínas, así como los niveles de traducción de cada región para proporcionar información sobre la expresión génica global. Antes de su desarrollo, los esfuerzos para medir la traducción in vivo incluían análisis de microarrays en el ARN aislado de polisomas , así como el perfil de traducción a través de la purificación por afinidad de ribosomas etiquetados con epítopo. Estos son métodos útiles y complementarios, pero ninguno permite la sensibilidad y la información posicional proporcionada por el perfil de ribosomas. [4]
Usos
Hay tres usos principales del perfil de ribosoma: identificar regiones de ARNm traducidas, observar cómo se pliegan los péptidos nacientes y medir la cantidad de proteínas específicas que se sintetizan.
Identificación de regiones de ARNm traducidas
Mediante el uso de fármacos específicos, el perfil de los ribosomas puede identificar las regiones de inicio de ARNm, las regiones de alargamiento y las áreas de estancamiento de la traducción. [5] Las regiones iniciadoras se pueden detectar agregando harringtonina o lactidomicina para evitar cualquier iniciación adicional. [5] Esto permite analizar el codón de inicio de los ARNm en todo el lisado celular , que se ha utilizado para determinar secuencias no AUG que inician la traducción . [1] Las otras regiones de alargamiento se pueden detectar agregando antibióticos como cicloheximida que inhibe la translocación, cloranfenicol que inhibe la transferencia de péptidos dentro del ribosoma o medios no farmacológicos como la congelación térmica. [5] Estos métodos de congelación por elongación permiten analizar la cinética de la traducción. Dado que varios ribosomas pueden traducir una sola molécula de ARNm para acelerar el proceso de traducción, RiboSeq demuestra las regiones codificantes de proteínas dentro del ARNm y la rapidez con la que esto se hace dependiendo del ARNm que se secuencia. [1] [6] Esto también permite que el perfil de los ribosomas muestre los sitios de pausa dentro del transcriptoma en codones específicos. [6] [7] Estos sitios de traducción lenta o pausada se demuestran mediante un aumento en la densidad de los ribosomas y estas pausas pueden vincular proteínas específicas con sus funciones dentro de la célula. [1]
Plegado de péptidos
El acoplamiento de perfiles de ribosomas con ChIP puede dilucidar cómo y cuándo se pliegan las proteínas recién sintetizadas. [1] Utilizando las huellas proporcionadas por Ribo-Seq, se pueden purificar los ribosomas específicos asociados con factores, como los acompañantes. Pausar el ribosoma en puntos de tiempo específicos, lo que le permite traducir un polipéptido a lo largo del tiempo, y exponer los diferentes puntos a una chaperona y precipitar con ChIP purifica estas muestras y puede mostrar en qué momento se está plegando el péptido. [1]
Medición de la síntesis de proteínas
Ribo-Seq también se puede utilizar para estimar la eficiencia de la traducción, un proxy para la síntesis de proteínas. Para esta aplicación, se generan perfiles de ribosomas y datos de secuenciación de ARN emparejados. Los análisis de datos iniciales se pueden lograr mediante marcos computacionales dedicados (por ejemplo, [8] ). La eficiencia de la traducción puede calcularse luego como la ocupación de ribosomas de cada gen mientras se controla su expresión de ARN. [9] [10] Este enfoque puede combinarse con la alteración dirigida de las proteínas que se unen al ARN y el uso de perfiles de ribosomas para medir la diferencia en la traducción. [7] Estos ARNm alterados pueden asociarse con proteínas, cuyos sitios de unión ya han sido mapeados en el ARN, para indicar regulación. [1] [7]
Procedimiento
- Lisar las células o el tejido y aislar las moléculas de ARNm unidas a los ribosomas.
- Inmovilizar complejos. Esto se realiza comúnmente con cicloheximida, pero se pueden emplear otros productos químicos. También es posible renunciar a los inhibidores de la traducción con condiciones de lisis incompetentes para la traducción.
- Usando ribonucleasas, digiera el ARN no protegido por los ribosomas.
- Aísle los complejos de ARNm-ribosoma mediante centrifugación de densidad en gradiente de sacarosa o columnas de cromatografía especializadas.
- Purificación de mezcla de fenol / cloroformo para eliminar proteínas.
- Seleccione el tamaño de los fragmentos de ARNm previamente protegidos.
- Ligar el adaptador de 3 'a los fragmentos.
- Reste los contaminantes de ARNr conocidos (opcional).
- Transcripción inversa de ARN a ADNc mediante transcriptasa inversa .
- Amplificar de manera específica de la hebra.
- Secuencia de lecturas.
- Alinee los resultados de la secuencia con la secuencia genómica para determinar el perfil de traducción. [11]
Materiales
- Complejos de ARN-ribosoma
- Cicloheximida
- Nucleasas
- Fenol / Cloroformo
- La transcriptasa inversa
- dNTP
- Método de secuenciación -biblioteca de ADNc. [11]
Referencias
- ↑ a b c d e f g h Ingolia NT (marzo de 2014). "Perfiles de ribosomas: nuevas vistas de la traducción, de codones individuales a escala del genoma". Reseñas de la naturaleza. Genética . 15 (3): 205-13. doi : 10.1038 / nrg3645 . PMID 24468696 . S2CID 13069682 .
- ^ a b Dougherty, Joseph D. (13 de diciembre de 2017). "El kit de herramientas en expansión de traducir purificación por afinidad de ribosomas" . Revista de neurociencia . 37 (50): 12079–12087. doi : 10.1523 / JNEUROSCI.1929-17.2017 . PMC 5729187 . PMID 29237735 .
- ^ Heiman M, Schaefer A, Gong S, Peterson JD, Day M, Ramsey KE; et al. (2008). "Un enfoque de perfiles de traducción para la caracterización molecular de los tipos de células del SNC" . Celular . 135 (4): 738–48. doi : 10.1016 / j.cell.2008.10.028 . PMC 2696821 . PMID 19013281 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ a b Weiss RB, Atkins JF (diciembre de 2011). "Biología molecular. La traducción se globaliza". Ciencia . 334 (6062): 1509–10. doi : 10.1126 / science.1216974 . PMID 22174241 . S2CID 206538968 .
- ^ a b c Michel AM, Baranov PV (septiembre de 2013). "Perfiles de ribosomas: un monitor de alta definición para la síntesis de proteínas en la escala de todo el genoma" . Revisiones interdisciplinarias de Wiley: ARN . 4 (5): 473–90. doi : 10.1002 / wrna.1172 . PMC 3823065 . PMID 23696005 .
- ^ a b Buskirk AR, Green R (marzo de 2017). "Pausa, detención y rescate de ribosomas en bacterias y eucariotas" . Transacciones filosóficas de la Royal Society de Londres. Serie B, Ciencias Biológicas . 372 (1716): 20160183. doi : 10.1098 / rstb.2016.0183 . PMC 5311927 . PMID 28138069 .
- ^ a b c Andreev DE, O'Connor PB, Loughran G, Dmitriev SE, Baranov PV, Shatsky IN (enero de 2017). "Conocimientos sobre los mecanismos de traducción eucariota obtenidos con perfiles de ribosomas" . Investigación de ácidos nucleicos . 45 (2): 513–526. doi : 10.1093 / nar / gkw1190 . PMC 5314775 . PMID 27923997 .
- ^ Ozadam, Hakan; Geng, Michael; Cenik, Can (1 de mayo de 2020). "RiboFlow, RiboR y RiboPy: un ecosistema para analizar datos de perfiles de ribosomas con resolución de longitud de lectura" . Bioinformática . 36 (9): 2929-2931. doi : 10.1093 / bioinformatics / btaa028 . ISSN 1367-4811 . PMC 7203755 . PMID 31930375 .
- ^ Oertlin, Christian; Lorent, Julie; Murie, Carl; Furic, Luc; Topisirovic, Ivan; Larsson, Ola (9 de julio de 2019). "Análisis de traducción de todo el transcriptoma de aplicación general utilizando anota2seq" . Investigación de ácidos nucleicos . 47 (12): e70. doi : 10.1093 / nar / gkz223 . ISSN 1362-4962 . PMC 6614820 . PMID 30926999 .
- ^ Cenik, Can; Cenik, Elif Sarinay; Byeon, Gun W .; Grubert, Fabián; Candille, Sophie I .; Spacek, Damek; Alsallakh, Bilal; Tilgner, Hagen; Araya, Carlos L .; Tang, Hua; Ricci, Emiliano (noviembre de 2015). "El análisis integrativo de los niveles de ARN, traducción y proteínas revela distintas variaciones regulatorias entre los seres humanos" . Investigación del genoma . 25 (11): 1610–1621. doi : 10.1101 / gr.193342.115 . ISSN 1549-5469 . PMC 4617958 . PMID 26297486 .
- ^ a b Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS (abril de 2009). "Análisis de todo el genoma in vivo de la traducción con resolución de nucleótidos utilizando perfiles de ribosomas" . Ciencia . 324 (5924): 218–23. Código Bibliográfico : 2009Sci ... 324..218I . doi : 10.1126 / science.1168978 . PMC 2746483 . PMID 19213877 .
enlaces externos
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