Primer walking (o secuenciación dirigida) es un método de secuenciación de elección para secuenciar fragmentos de ADN entre 1,3 y 7 kilobases . Tales fragmentos son demasiado largos para secuenciarlos en una sola secuencia leída usando el método de terminación de cadena . Este método funciona dividiendo la secuencia larga en varias cortas consecutivas. El ADN de interés puede ser un inserto de plásmido , un producto de PCR o un fragmento que representa un espacio al secuenciar un genoma. El término "caminata del cebador" se utiliza cuando el objetivo principal es secuenciar el genoma. El término " cromosoma que camina"se usa en su lugar cuando se conoce la secuencia pero no hay un clon de un gen. Por ejemplo, el gen de una enfermedad puede estar ubicado cerca de un marcador específico como un RFLP en la secuencia. [1]
El fragmento se secuencia primero como si fuera un fragmento más corto. La secuenciación se realiza desde cada extremo utilizando cebadores universales o diseñados específicamente. Esto debería identificar las primeras 1000 bases aproximadamente. Para secuenciar completamente la región de interés, es necesario el diseño y síntesis de nuevos cebadores (complementarios a las 20 bases finales de la secuencia conocida) para obtener información de secuencia contigua. [2]
Proceso
El proceso general es el siguiente:
- Se utiliza un cebador que hace coincidir el comienzo del ADN con la secuencia para sintetizar una hebra corta de ADN adyacente a la secuencia desconocida, comenzando con el cebador (ver PCR ).
- La nueva cadena corta de ADN se secuencia mediante el método de terminación de cadena.
- El final de la hebra secuenciada se usa como cebador para la siguiente parte de la secuencia larga de ADN, de ahí el término "caminar".
El método se puede utilizar para secuenciar cromosomas completos (de ahí "caminar cromosomas"). [3] El paso de cebadores también fue la base para el desarrollo de la secuenciación de escopeta , que utiliza cebadores aleatorios en lugar de los elegidos específicamente.
Ver también
- Salto de cromosomas
- Aterrizaje de cromosomas
- Secuencia de escopeta : un método alternativo que utiliza subcadenas aleatorias, en lugar de consecutivas.
Referencias
- ^ Cann, Alan (1999). Virus de ADN: un enfoque práctico . Prensa de la Universidad de Oxford. ISBN 978-0-19-963718-8.
- ^ Sterky, Fredrik; Lundeberg, Joakim (2000). "Análisis de secuencia de genes y genomas" (PDF) . Revista de Biotecnología . 76 (1): 1–31. doi : 10.1016 / s0168-1656 (99) 00176-5 . PMID 10784293 .
- ^ Chinault, A. Craig; John Carbon (febrero de 1979). "Cribado de hibridación de superposición: aislamiento y caracterización de fragmentos de ADN superpuestos que rodean el gen leu2 en el cromosoma III de levadura". Gene . 5 (2): 111–126. doi : 10.1016 / 0378-1119 (79) 90097-0 . PMID 376402 .