Un mapa de restricción es un mapa de sitios de restricción conocidos dentro de una secuencia de ADN . El mapeo de restricción requiere el uso de enzimas de restricción . En biología molecular , los mapas de restricción se utilizan como referencia para diseñar plásmidos u otros fragmentos de ADN relativamente cortos y, a veces, para ADN genómico más largo. Hay otras formas de mapear características en el ADN para moléculas de ADN de mayor longitud, como el mapeo por transducción . [1]
Un enfoque para construir un mapa de restricción de una molécula de ADN es secuenciar la molécula completa y ejecutar la secuencia a través de un programa informático que encontrará los sitios de reconocimiento que están presentes para cada enzima de restricción conocida.
Antes de que se automatizara la secuenciación, habría sido prohibitivamente caro secuenciar una cadena completa de ADN. Para encontrar las posiciones relativas de los sitios de restricción en un plásmido, se usa una técnica que implica digestiones de restricción simple y doble. Basándose en los tamaños de los fragmentos de ADN resultantes, se pueden inferir las posiciones de los sitios. El mapeo de restricción es una técnica muy útil cuando se usa para determinar la orientación de un inserto en un vector de clonación, al mapear la posición de un sitio de restricción descentrado en el inserto. [2]
Método
El procedimiento experimental primero requiere una alícuota de ADN plasmídico purificado (ver apéndice) para cada digestión a ejecutar. A continuación, se realiza la digestión con cada enzima elegida. Las muestras resultantes se procesan posteriormente en un gel de electroforesis , típicamente en gel de agarosa .
El primer paso que sigue a la finalización de la electroforesis es sumar los tamaños de los fragmentos en cada carril. La suma de los fragmentos individuales debe ser igual al tamaño del fragmento original, y los fragmentos de cada resumen también deben sumar el mismo tamaño que los demás. Si los tamaños de los fragmentos no se suman correctamente, es probable que existan dos problemas. En un caso, es posible que algunos de los fragmentos más pequeños se hayan escurrido por el extremo del gel. Esto ocurre con frecuencia si el gel se pasa demasiado tiempo. Una segunda posible fuente de error es que el gel no era lo suficientemente denso y, por lo tanto, no pudo resolver fragmentos de tamaño cercano. Esto conduce a una falta de separación de fragmentos de tamaño similar. Si todos los digestiones producen fragmentos que se suman, se puede inferir la posición de los sitios REN (endonucleasa de restricción) colocándolos en puntos del fragmento de ADN original que satisfarían los tamaños de fragmentos producidos por los tres digestiones.
Consulte también enzimas de restricción para obtener más detalles sobre las enzimas explotadas en esta técnica.
Desnaturalización y renaturalización rápidas de una preparación de ADN crudo mediante lisis alcalina de las células y posterior neutralización
En esta técnica, las células se lisan en condiciones alcalinas. El ADN de la mezcla se desnaturaliza (las hebras se separan) rompiendo los enlaces de hidrógeno entre las dos hebras. El ADN genómico grande está sujeto a enredarse y permanecer desnaturalizado cuando se baja el pH durante la neutralización. En otras palabras, las hebras se vuelven a unir de forma desordenada, emparejándose de forma aleatoria. Las hebras circulares de los plásmidos superenrollados permanecerán relativamente alineadas y se renaturalizarán correctamente. Por lo tanto, el ADN genómico formará un agregado insoluble y los plásmidos superenrollados se dejarán en solución. A esto le puede seguir la extracción de fenol para eliminar proteínas y otras moléculas. Luego, el ADN puede someterse a precipitación con etanol para concentrar la muestra.
Ver también
- Vector NTI , software bioinformático utilizado, entre otras cosas, para predecir sitios de restricción en un vector de ADN
- RFLP , método utilizado para diferenciar genomas extremadamente similares, entre otras cosas
Referencias
- ^ Bitner, R; Kuempel, Peter (febrero de 1982). "Mapeo de transducción P1 del locus trg en cepas rac + y rac de Escherichia coli K-12" (PDF) . Revista de bacteriología . 149 (2): 529–533. doi : 10.1128 / JB.149.2.529-533.1982 .
- ^ Dale, J; von Schantz, M; Greenspan, D (2003). De genes a genomas . West Sussex: John Wiley & Sons Ltd.