La precipitación con etanol es un método utilizado para purificar y / o concentrar ARN , ADN y polisacáridos como pectina y xiloglucano de soluciones acuosas mediante la adición de etanol como antidisolvente.
Precipitación de ADN
Teoría
El ADN es polar debido a su estructura de fosfato altamente cargada . Su polaridad lo hace soluble en agua (el agua es polar) de acuerdo con el principio "como se disuelve como" .
Debido a la alta polaridad del agua, ilustrada por su alta constante dieléctrica de 80,1 (a 20 ° C), las fuerzas electrostáticas entre las partículas cargadas son considerablemente más bajas en una solución acuosa que en el vacío o en el aire.
Esta relación se refleja en la ley de Coulomb , que se puede utilizar para calcular la fuerza que actúa sobre dos cargas. y separados por una distancia utilizando la constante dieléctrica (también llamada permitividad estática relativa) del medio en el denominador de la ecuación (es una constante eléctrica ):
A nivel atómico, la reducción de la fuerza que actúa sobre una carga se debe a que las moléculas de agua forman una capa de hidratación a su alrededor. Este hecho hace que el agua sea un muy buen disolvente para compuestos cargados como las sales. La fuerza eléctrica que normalmente mantiene unidos los cristales de sal mediante enlaces iónicos se debilita en presencia de agua, lo que permite que los iones se separen del cristal y se extiendan a través de la solución.
El mismo mecanismo opera en el caso de grupos fosfato cargados negativamente en una columna vertebral de ADN: aunque los iones positivos están presentes en la solución, la fuerza electrostática neta relativamente débil les impide formar enlaces iónicos estables con los fosfatos y precipitarse de la solución.
El etanol es mucho menos polar que el agua, con una constante dieléctrica de 24,3 (a 25 ° C). Esto significa que la adición de etanol a la solución interrumpe el filtrado de cargas por el agua. Si se agrega suficiente etanol, la atracción eléctrica entre los grupos fosfato y los iones positivos presentes en la solución se vuelve lo suficientemente fuerte como para formar enlaces iónicos estables y precipitación del ADN. Esto suele ocurrir cuando el etanol compone más del 64% de la solución. Como sugiere el mecanismo, la solución debe contener iones positivos para que ocurra la precipitación; generalmente Na + , NH 4 + o Li + desempeña este papel. [1]
Práctica
El ADN se precipita asegurándose primero de que la concentración correcta de iones positivos esté presente en la solución (demasiada dará como resultado una gran cantidad de sal que coprecipitará con el ADN, muy poca dará como resultado una recuperación incompleta del ADN) y luego agregando dos o tres volúmenes de al menos 95% de etanol. Muchos protocolos recomiendan almacenar el ADN a baja temperatura en este punto, pero también hay observaciones de que puede no mejorar la recuperación del ADN e incluso puede reducir la eficiencia de la precipitación mientras se usa el tiempo de incubación durante la noche. [2] [3] Por lo tanto, se puede lograr una buena eficiencia a temperatura ambiente, pero cuando se tiene en cuenta la posible degradación, probablemente sea mejor incubar el ADN en hielo húmedo. El tiempo de incubación óptimo depende de la longitud y la concentración de ADN. Los fragmentos más pequeños y las concentraciones más bajas requerirán más tiempo para lograr una recuperación aceptable. Para longitudes muy pequeñas y concentraciones bajas, se recomienda la incubación durante la noche. En tales casos, el uso de vehículos como ARNt , glucógeno o poliacrilamida lineal puede mejorar enormemente la recuperación.
Durante la incubación, el ADN y algunas sales precipitarán de la solución; en el siguiente paso, este precipitado se recoge mediante centrifugación en un tubo de microcentrífuga a altas velocidades (~ 12.000 g ). El tiempo y la velocidad de centrifugación tienen el mayor efecto sobre las tasas de recuperación de ADN. Nuevamente, los fragmentos más pequeños y las diluciones más altas requieren una centrifugación más rápida y prolongada. La centrifugación se puede realizar a temperatura ambiente o en 4 ° C o 0 ° C. Durante la centrifugación, el ADN precipitado tiene que moverse a través de la solución de etanol hasta el fondo del tubo, las temperaturas más bajas aumentan la viscosidad de la solución y los volúmenes más grandes hacen que la distancia sea más larga, por lo que ambos factores reducen la eficiencia de este proceso que requiere una centrifugación más prolongada para obtener el mismo efecto. [2] [3] Después de la centrifugación, se retira la solución sobrenadante, dejando un sedimento de ADN crudo. El hecho de que el sedimento sea visible depende de la cantidad de ADN y de su pureza (los sedimentos más sucios son más fáciles de ver) o del uso de coprecipitantes.
En el siguiente paso, se agrega etanol al 70% al gránulo y se mezcla suavemente para soltar el gránulo y lavarlo. Esto elimina algunas de las sales presentes en el sobrenadante sobrante y se unen al sedimento de ADN para hacer el ADN final más limpio. Esta suspensión se centrifuga nuevamente para sedimentar nuevamente el ADN y se retira la solución sobrenadante. Este paso se repite una vez.
Finalmente, el sedimento se seca al aire y el ADN se resuspende en agua u otro tampón deseado . Es importante no secar demasiado el sedimento, ya que puede provocar la desnaturalización del ADN y dificultar la resuspensión.
También se puede utilizar isopropanol en lugar de etanol; la eficiencia de precipitación del isopropanol es mayor, lo que hace que un volumen sea suficiente para la precipitación. Sin embargo, el isopropanol es menos volátil que el etanol y necesita más tiempo para secarse al aire en el paso final. El gránulo también puede adherirse menos al tubo cuando se usa isopropanol. [1]
Ver también
Referencias
- ^ a b Clonación molecular: un manual de laboratorio (tercera edición) por Joseph Sambrook , Peter MacCallum Cancer Institute , Melbourne, Australia; David Russell, Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas, Dallas
- ↑ a b Zeugin JA, Hartley JL (1985). "Precipitación de ADN con etanol" (PDF) . Enfoque . 7 (4): 1–2 . Consultado el 10 de septiembre de 2008 .
- ^ a b Crouse J, Amorese D (1987). "Precipitación de etanol: acetato de amonio como alternativa al acetato de sodio" (PDF) . Enfoque . 9 (2): 3–5. Archivado desde el original (PDF) el 22 de noviembre de 2009 . Consultado el 10 de septiembre de 2008 .
enlaces externos
- bitesizebio.com Lo básico: cómo funciona la precipitación de ADN y ARN con etanol
- Zeugin JA, Hartley JL (1985). "Precipitación de ADN con etanol" (PDF) . Enfoque . 7 (4): 1–2 . Consultado el 10 de septiembre de 2008 .
- Crouse J, Amorese D (1987). "Precipitación de etanol: acetato de amonio como alternativa al acetato de sodio" (PDF) . Enfoque . 9 (2): 3–5. Archivado desde el original (PDF) el 22 de noviembre de 2009 . Consultado el 10 de septiembre de 2008 .