La clonación TOPO es una técnica de biología molecular en la que se clonan fragmentos de ADN en vectores específicos sin necesidad de ligasas de ADN . La polimerasa Taq tiene una actividad de transferasa terminal no dependiente de plantilla que agrega una sola desoxiadenosina (A) al extremo 3' de los productos de PCR. Esta característica se explota en la clonación TOPO TA de "extremo pegajoso". [1] Para la clonación TOPO de "extremo romo", el vector receptor no tiene salientes y se pueden clonar fragmentos de ADN de extremos romos.
La técnica utiliza la actividad biológica inherente de la topoisomerasa I de ADN. El papel biológico de la topoisomerasa es dividir y volver a unir los extremos de ADN superenrollados para facilitar la replicación. La topoisomerasa I del virus vaccinia reconoce específicamente la secuencia de ADN 5'-(C/T)CCTT-3'. Durante la replicación , la enzima digiere el ADN específicamente en esta secuencia, desenrolla el ADN y lo vuelve a ligar en el grupo fosfato 3' de la base de timidina . [1]
Los vectores TOPO están diseñados de tal manera que llevan esta secuencia específica 5´-(C/T)CCTT-3' en los dos extremos lineales. El ADN del vector lineal ya tiene la enzima topoisomerasa unida covalentemente a los extremos 3' libres de sus dos hebras. Esto luego se mezcla con productos de PCR. Cuando los extremos 5' libres de las cadenas del producto PCR se unen al extremo 3' de la topoisomerasa de cada cadena del vector, las cadenas se unen covalentemente por la topoisomerasa ya unida. Esta reacción procede de manera eficiente cuando esta solución se incuba a temperatura ambiente con la sal requerida. Se utilizan diferentes tipos de vectores para clonar fragmentos amplificados por polimerasa Taq o Pfu, ya que la polimerasa Taq (a diferencia de Pfu) deja un nucleótido "A" adicional en el extremo 3' durante la amplificación. [1]
La técnica de clonación TA TOPO se basa en la capacidad de la adenina (A) y la timina (T) (pares de bases complementarios) en diferentes fragmentos de ADN para hibridar y, en presencia de ligasa o topoisomerasa, ligarse entre sí. El inserto se crea mediante PCR usando ADN polimerasa Taq, una polimerasa que carece de actividad de corrección de pruebas de 3' a 5' y que con una alta probabilidad agrega un solo saliente de 3'-adenina a cada extremo del producto de PCR. Lo mejor es que los cebadores de PCR tengan guaninas en el extremo 5', ya que esto maximiza la probabilidad de que la ADN polimerasa Taq agregue el saliente de adenosina terminal. No se deben utilizar polimerasas termoestables que contengan una extensa actividad de exonucleasa de 3´ a 5´ ya que no dejan los salientes de adenina 3´. El vector diana se linealiza y se corta con una enzima de restricción de extremos romos. A continuación, este vector se une a la cola con trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) usando transferasa terminal. Es importante usar ddTTP para garantizar la adición de un solo residuo T. Esta cola deja el vector con un solo residuo de timina que sobresale en 3' en cada extremo romo.[1]
Las polimerasas (como Phusion) o las enzimas de restricción que producen extremos romos también se pueden usar para la clonación TOPO. En lugar de depender de extremos cohesivos, el vector TOPO de extremo romo tiene extremos romos donde se unen las moléculas de topoisomerasa. Hay kits comerciales disponibles, como el kit de clonación Zero Blunt® de Invitrogen. [2]