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ADN ligasa
Reparación de ADN.jpg
Concepción artística de la ADN ligasa que repara el daño cromosómico
Identificadores
CE no.6.5.1.1
No CAS.9015-85-4
Bases de datos
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MetaCyccamino metabólico
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NCBIproteinas
ligasa I, ADN, dependiente de ATP
DNA Ligase.jpg
Identificadores
SímboloLIG1
Gen NCBI3978
HGNC6598
OMIM126391
RefSeqNM_000234
UniProtP18858
Otros datos
LugarChr. 19 [1]
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DominiosInterPro
ligasa III, ADN, dependiente de ATP
Identificadores
SímboloLIG3
Gen NCBI3980
HGNC6600
OMIM600940
RefSeqNM_002311
UniProtP49916
Otros datos
LugarChr. 17 q11.2-q12
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La ADN ligasa es un tipo específico de enzima, una ligasa ( EC 6.5.1.1 ) que facilita la unión de las cadenas de ADN al catalizar la formación de un enlace fosfodiéster . Desempeña un papel en la reparación de roturas de una sola hebra en el ADN dúplex en organismos vivos, pero algunas formas (como la ADN ligasa IV ) pueden reparar específicamente las roturas de doble hebra (es decir, una rotura en ambas hebras complementarias de ADN). Las roturas de una sola hebra son reparadas por la ADN ligasa utilizando la hebra complementaria de la doble hélice como plantilla, [1] con la ADN ligasa creando el enlace fosfodiéster final para reparar completamente el ADN.

La ADN ligasa se usa tanto en la reparación del ADN como en la replicación del ADN (ver Ligasas de mamíferos ). Además, la ADN ligasa tiene un amplio uso en los laboratorios de biología molecular para experimentos de ADN recombinante (consulte Aplicaciones de investigación ). La ADN ligasa purificada se utiliza en la clonación de genes para unir moléculas de ADN y formar ADN recombinante .

Mecanismo enzimático [ editar ]

La imagen demuestra cómo la ligasa (óvalo amarillo) cataliza dos hebras de fragmentos de ADN. La ligasa une los dos fragmentos de ADN para formar una cadena más larga de ADN "pegándolos" juntos.

El mecanismo de la ADN ligasa es formar dos enlaces fosfodiéster covalentes entre los extremos hidroxilo 3 ' de un nucleótido ("aceptor"), con el extremo fosfato 5' de otro ("donante"). Se consumen dos moléculas de ATP por cada enlace fosfodiéster formado. Se requiere AMP para la reacción de la ligasa, que se desarrolla en cuatro pasos:

  1. Reorganización del sitio de actividad, como mellas en segmentos de ADN o fragmentos de Okazaki, etc.
  2. Se libera la adenilación (adición de AMP) de un residuo de lisina en el centro activo de la enzima, pirofosfato ;
  3. Transferencia del AMP al fosfato 5 'del llamado donante, formación de un enlace pirofosfato;
  4. Formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5 'del donante y el hidroxilo 3' del aceptor. [2]
Un ejemplo gráfico de cómo funciona una ligasa (con extremos pegajosos )

La ligasa también funcionará con extremos romos , aunque se requieren concentraciones de enzima más altas y diferentes condiciones de reacción.

Tipos [ editar ]

E. coli [ editar ]

La ADN ligasa de E. coli está codificada por el gen lig . La ADN ligasa en E. coli , así como en la mayoría de los procariotas, utiliza la energía obtenida al escindir el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) para crear el enlace fosfodiéster. [3] No liga el ADN de extremos romos, excepto en condiciones de apiñamiento molecular con polietilenglicol , y no puede unir el ARN al ADN de manera eficiente.

La actividad de la ADN ligasa de E. coli puede potenciarse mediante la ADN polimerasa en las concentraciones adecuadas. La mejora solo funciona cuando las concentraciones de la ADN polimerasa 1 son mucho más bajas que los fragmentos de ADN que se van a ligar. Cuando las concentraciones de polimerasas de ADN Pol I son más altas, tiene un efecto adverso sobre la ligasa de ADN de E. coli [4]

T4 [ editar ]

La ADN ligasa del bacteriófago T4 (un bacteriófago que infecta la bacteria Escherichia coli ). La ligasa T4 es la más utilizada en la investigación de laboratorio. [5] Puede ligar extremos cohesivos o romos de ADN, oligonucleótidos, así como ARN e híbridos de ARN-ADN, pero no ácidos nucleicos monocatenarios. También puede ligar ADN de extremos romos con una eficacia mucho mayor que la ADN ligasa de E. coli . A diferencia de la ADN ligasa de E. coli, la ADN ligasa T4 no puede utilizar NAD y tiene un requisito absoluto de ATP como cofactor. Se han realizado algunos trabajos de ingeniería para mejorar los resultados in vitro.actividad de la ADN ligasa de T4; Un enfoque exitoso, por ejemplo, probó la ligasa de ADN de T4 fusionada con varias proteínas de unión al ADN alternativas y descubrió que las construcciones con p50 o NF-kB como parejas de fusión eran más de un 160% más activas en las ligaciones de extremos romos con fines de clonación que las de tipo salvaje ADN ligasa T4. [6] Una reacción típica para insertar un fragmento en un vector plasmídico usaría aproximadamente 0.01 (extremos pegajosos) a 1 (extremos romos) unidades de ligasa. La temperatura de incubación óptima para la ADN ligasa T4 es de 16 ° C.

Los mutantes de la ligasa del bacteriófago T4 tienen una mayor sensibilidad tanto a la irradiación UV [7] [8] como al agente alquilante metil metanosulfonato [9], lo que indica que la ADN ligasa se emplea en la reparación de los daños en el ADN causados ​​por estos agentes.

Mamífero [ editar ]

En los mamíferos, hay cuatro tipos específicos de ligasa.

  1. ADN ligasa I : liga el ADN naciente de la hebra rezagada después de que la Ribonucleasa H haya eliminado el cebador de ARN de los fragmentos de Okazaki .
  2. ADN ligasa III : se compleja con la proteína de reparación del ADN XRCC1 para ayudar a sellar el ADN durante el proceso de reparación por escisión de nucleótidos y fragmentos recombinantes. De todas las ADN ligasas conocidas de mamíferos, solo se ha encontrado que Lig III está presente en las mitocondrias.
  3. ADN ligasa IV : complejos con XRCC4 . Cataliza el paso final en la ruta de reparación de rotura de doble hebra de ADN de unión de extremos no homólogos . También se requiere para la recombinación V (D) J , el proceso que genera diversidad en los loci de receptores de células T e inmunoglobulinas durante el desarrollo del sistema inmunológico .
  • ADN ligasa II: un artefacto de purificación resultante de la degradación proteolítica de ADN ligasa III. Inicialmente, ha sido reconocida como otra ADN ligasa y es la razón de la inusual nomenclatura de las ADN ligasas. [10]

La ADN ligasa de eucariotas y algunos microbios usa trifosfato de adenosina (ATP) en lugar de NAD. [3]

Termoestable [ editar ]

Derivado de una bacteria termófila, la enzima es estable y activa a temperaturas mucho más altas que las ligasas de ADN convencionales. Su vida media es de 48 horas a 65 ° C y superior a 1 hora a 95 ° C. Se ha demostrado que la ampligasa ADN ligasa es activa durante al menos 500 ciclos térmicos (94 ° C / 80 ° C) o 16 horas de ciclos. 10  Esta termoestabilidad excepcional permite una rigurosidad de hibridación y una especificidad de ligadura extremadamente altas. [11]

Medición de actividad [ editar ]

Hay al menos tres unidades diferentes que se utilizan para medir la actividad de la ADN ligasa: [12]

  • Unidad de Weiss : la cantidad de ligasa que cataliza el intercambio de 1 nmol de 32 P de pirofosfato inorgánico a ATP en 20 minutos a 37 ° C. Este es el más comúnmente utilizado.
  • Unidad Modrich-Lehman : se utiliza con poca frecuencia y una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 100 nmoles de d (AT) n en una forma resistente a exonucleasa III en 30 minutos en condiciones estándar.
  • Muchos proveedores comerciales de ligasas utilizan una unidad arbitraria basada en la capacidad de la ligasa para ligar extremos cohesivos. Estas unidades suelen ser más subjetivas que cuantitativas y carecen de precisión.

Aplicaciones de investigación [ editar ]

Artículo principal: Ligadura (biología molecular)

Las ADN ligasas se han convertido en herramientas indispensables en la investigación de biología molecular moderna para generar secuencias de ADN recombinante . Por ejemplo, las ADN ligasas se utilizan con enzimas de restricción para insertar fragmentos de ADN, a menudo genes , en plásmidos .

El control de la temperatura óptima es un aspecto vital de la realización de experimentos de recombinación eficientes que implican la ligación de fragmentos de extremos cohesivos. La mayoría de los experimentos utilizan T4 ADN ligasa (aislada del bacteriófago T4 ), que es más activa a 37 ° C. [13] Sin embargo, para una eficacia de ligación óptima con fragmentos de extremos cohesivos ("extremos pegajosos"), la temperatura óptima de la enzima debe equilibrarse con la temperatura de fusión T m de los extremos pegajosos que se ligan, [14] el emparejamiento homólogo de los los extremos pegajosos no serán estables porque la alta temperatura interrumpe los enlaces de hidrógeno. Una reacción de ligación es más eficaz cuando los extremos pegajosos ya están recocidos de forma estable y, por lo tanto, la rotura de los extremos de hibridación daría como resultado una baja eficacia de ligación. Cuanto más corto sea el voladizo , menor será la T m .

Dado que los fragmentos de ADN de extremos romos no tienen extremos cohesivos para hibridar, la temperatura de fusión no es un factor a considerar dentro del rango de temperatura normal de la reacción de ligación. El factor limitante en la ligadura de extremos romos no es la actividad de la ligasa, sino el número de alineamientos entre los extremos de los fragmentos de ADN que se producen. Por tanto, la temperatura de ligación más eficaz para el ADN de extremos romos sería la temperatura a la que puede producirse el mayor número de alineaciones. La mayoría de las ligaduras de extremos romos se llevan a cabo a 14-25 ° C durante la noche. La ausencia de extremos recocidos de forma estable también significa que la eficacia de la ligadura se reduce, lo que requiere el uso de una concentración de ligasa más alta. [14]

Se puede ver un uso novedoso de la ADN ligasa en el campo de la nanoquímica, específicamente en el origami de ADN. Los principios de autoensamblaje basados ​​en ADN han demostrado ser útiles para organizar objetos a nanoescala, como biomoléculas, nanomáquinas, componentes nanoelectrónicos y fotónicos. El ensamblaje de tal nanoestructura requiere la creación de una intrincada malla de moléculas de ADN. Aunque el autoensamblaje del ADN es posible sin ninguna ayuda externa utilizando diferentes sustratos, como la provisión de superficie catatónica de papel de aluminio, la ligasa de ADN puede proporcionar la asistencia enzimática que se requiere para hacer una estructura de red de ADN a partir de ADN colgado. [15]

Historia [ editar ]

La primera ADN ligasa fue purificada y caracterizada en 1967 por los laboratorios Gellert, Lehman, Richardson y Hurwitz. [16] Primero fue purificado y caracterizado por Weiss y Richardson usando un proceso de fraccionamiento cromatográfico de seis pasos que comienza con la eliminación de los desechos celulares y la adición de estreptomicina, seguido de varios lavados de columna de dietilaminoetil (DEAE) -celulosa y un fraccionamiento final de fosfocelulosa. El extracto final contenía el 10% de la actividad registrada inicialmente en el medio de  E. coli  ; a lo largo del proceso se descubrió que el ATP y el Mg ++ eran necesarios para optimizar la reacción. Las ADN ligasas comunes disponibles comercialmente se descubrieron originalmente en el bacteriófago T4 , E. coli y otrosbacterias . [17]

Trastornos [ editar ]

Las deficiencias genéticas en las ADN ligasas humanas se han asociado con síndromes clínicos marcados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y anomalías del desarrollo.  [16] El síndrome LIG4 ( síndrome de Ligasa IV) es una enfermedad rara asociada con mutaciones en la ADN ligasa 4 e interfiere con la ruptura del ADN bicatenario. mecanismos de reparación. El síndrome de ligasa IV causa inmunodeficiencia en individuos y comúnmente se asocia con microcefalia e hipoplasia medular. [18] A continuación se incluye una lista de enfermedades prevalentes causadas por la falta o el mal funcionamiento de la ADN ligasa.

Xeroderma pigmentosum [ editar ]

Xeroderma pigmentosum, que se conoce comúnmente como XP, es una afección hereditaria caracterizada por una sensibilidad extrema a los rayos ultravioleta (UV) de la luz solar. Esta condición afecta principalmente a los ojos y áreas de piel expuestas al sol. Algunas personas afectadas también tienen problemas relacionados con el sistema nervioso. [19]

Ataxia-telangiectasia [ editar ]

Las mutaciones en el gen ATM causan  ataxia-telangiectasia. El gen ATM proporciona instrucciones para producir una proteína que ayuda a controlar la división celular y participa en la reparación del ADN. Esta proteína juega un papel importante en el desarrollo normal y la actividad de varios sistemas del cuerpo, incluidos el sistema nervioso y el sistema inmunológico. La proteína ATM ayuda a las células a reconocer hebras de ADN dañadas o rotas y coordina la reparación del ADN activando enzimas que reparan las hebras rotas. La reparación eficaz de las hebras de ADN dañadas ayuda a mantener la estabilidad de la información genética de la célula. Los niños afectados suelen desarrollar dificultad para caminar, problemas con el equilibrio y la coordinación de las manos, movimientos espasmódicos involuntarios (corea), espasmos musculares (mioclonías) y alteraciones en la función nerviosa (neuropatía). Los problemas de movimiento suelen hacer que las personas necesiten asistencia en silla de ruedas en la adolescencia.Las personas con este trastorno también tienen dificultad para hablar y dificultad para mover los ojos para mirar de lado a lado (apraxia oculomotora).[20]

Anemia de Fanconi [ editar ]

La anemia de Fanconi (FA) es un trastorno sanguíneo hereditario poco común que conduce a insuficiencia de la médula ósea. La FA evita que la médula ósea produzca suficientes células sanguíneas nuevas para que el cuerpo funcione normalmente. La FA también puede hacer que la médula ósea produzca muchas células sanguíneas defectuosas. Esto puede provocar problemas de salud graves, como leucemia . [21]

Síndrome de Bloom [ editar ]

El síndrome de Bloom da como resultado una piel sensible a la exposición al sol y, por lo general, el desarrollo de un parche de piel enrojecida en forma de mariposa en la nariz y las mejillas. También puede aparecer una erupción cutánea en otras áreas que normalmente están expuestas al sol, como el dorso de las manos y los antebrazos. A menudo aparecen pequeños grupos de vasos sanguíneos agrandados (telangiectasias) en la erupción; las telangiectasias también pueden ocurrir en los ojos. Otras características de la piel incluyen parches de piel que son más claros o más oscuros que las áreas circundantes (hipopigmentación o hiperpigmentación, respectivamente). Estos parches aparecen en áreas de la piel que no están expuestas al sol y su desarrollo no está relacionado con las erupciones.

Como objetivo de drogas [ editar ]

En estudios recientes, se utilizó ADN ligasa I humana en el diseño de fármacos asistido por computadora para identificar inhibidores de ADN ligasa como posibles agentes terapéuticos para tratar el cáncer. [22] Dado que el crecimiento celular excesivo es un sello distintivo del desarrollo del cáncer, la quimioterapia dirigida que interrumpe el funcionamiento de la ADN ligasa puede impedir las formas adyuvantes de cáncer. Además, se ha demostrado que las ADN ligasas se pueden dividir ampliamente en dos categorías, a saber, dependientes de ATP y NAD + . Investigaciones anteriores han demostrado que aunque se han descubierto ADN ligasas dependientes de NAD + en nichos celulares o virales esporádicos fuera del dominio bacteriano de la vida, no hay ningún caso en el que una ligasa dependiente de NAD + esté presente en un eucariota.organismo. La presencia únicamente en organismos no eucariotas, la especificidad de sustrato única y la estructura de dominio distintiva de las ADN ligasas dependientes de NAD + en comparación con las ligasas de ADN humanas dependientes de ATP juntas hacen que las ligasas dependientes de NAD + sean dianas ideales para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos. [dieciséis]

Ver también [ editar ]

  • Final del ADN
  • Hebra rezagada
  • Replicación de ADN
  • Fragmento de Okazaki
  • ADN polimerasa
  • Secuenciación por ligadura

Referencias [ editar ]

  1. ^ Pascal JM, O'Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (noviembre de 2004). "La ADN ligasa humana I rodea completamente y desenrolla parcialmente el ADN mellado". Naturaleza . 432 (7016): 473–8. Código Bibliográfico : 2004Natur.432..473P . doi : 10.1038 / nature03082 . PMID  15565146 . S2CID  3105417 .
  2. ^ Lehman IR (noviembre de 1974). "ADN ligasa: estructura, mecanismo y función". Ciencia . 186 (4166): 790–7. Código Bibliográfico : 1974Sci ... 186..790L . doi : 10.1126 / science.186.4166.790 . PMID 4377758 . S2CID 86549159 .  
  3. ↑ a b Foster JB, Slonczewski J (2010). Microbiología: una ciencia en evolución (Segunda ed.). Nueva York: WW Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2.
  4. ^ Yang Y, LiCata VJ (febrero de 2018). "Las polimerasas de ADN Pol I estimulan la unión de los extremos del ADN por la ligasa de ADN de Escherichia coli". Comunicaciones de investigación bioquímica y biofísica . 497 (1): 13-18. doi : 10.1016 / j.bbrc.2018.01.165 . PMID 29409896 . 
  5. ^ "Ligas" (PDF) . Guía de recursos enzimáticos . Promega Corporation. págs. 8-14.
  6. ^ Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (julio de 2013). "ADN ligasas manipuladas con actividades mejoradas in vitro" . Ingeniería, Diseño y Selección de Proteínas . 26 (7): 471–8. doi : 10.1093 / protein / gzt024 . PMID 23754529 . 
  7. ↑ Baldy MW (1968). "Reparación y recombinación en fago T4. II. Genes que afectan la sensibilidad UV". Simposios de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa . 33 : 333–8. doi : 10.1101 / sqb.1968.033.01.038 . PMID 4891973 . 
  8. ^ Baldy MW (febrero de 1970). "La sensibilidad a los rayos UV de algunos mutantes sensibles a la temperatura de función temprana del fago T4". Virología . 40 (2): 272–87. doi : 10.1016 / 0042-6822 (70) 90403-4 . PMID 4909413 . 
  9. ↑ Baldy MW, Strom B, Bernstein H (marzo de 1971). "Reparación de ácido desoxirribonucleico del bacteriófago T4 alquilado por un mecanismo que involucra polinucleótido ligasa" . Revista de Virología . 7 (3): 407–8. doi : 10.1128 / JVI.7.3.407-408.1971 . PMC 356131 . PMID 4927528 .  
  10. ^ Tomkinson, Alan E; Sallmyr, Annahita (5 de septiembre de 2013). "Estructura y función de las ADN ligasas codificadas por el gen LIG3 de mamífero" . Gene . 531 (2): 150-157. doi : 10.1016 / j.gene.2013.08.061 . PMC 3881560 . PMID 24013086 . Consultado el 21 de febrero de 2021 .  
  11. ^ "Ampligasa-ADN ligasa termoestable" . www.epibio.com . Consultado el 15 de mayo de 2017 .
  12. ^ Russell DW, Sambrook J (2001). "Capítulo 1: Plásmidos y su utilidad en la clonación molecular". Clonación molecular: un manual de laboratorio . 1 (3ª ed.). Cold Spring Harbor, Nueva York: Laboratorio de Cold Spring Harbor. págs. 1-159. ISBN 978-0-87969-577-4.
  13. ^ Baneyx F, Lucotte G (1993). Introducción a las técnicas de clonación molecular . Chichester: John Wiley & Sons. pag. 156. ISBN 978-0-471-18849-0.
  14. ^ a b Tabor S (mayo de 2001). "ADN ligasas". Protocolos actuales en biología molecular . Capítulo 3: Unidad 3.14. doi : 10.1002 / 0471142727.mb0314s08 . ISBN 978-0-471-14272-0. PMID  18265223 . S2CID  23944826 .
  15. ^ Bhanjadeo MM, Nayak AK, Subudhi U (2017). "Autoensamblaje de ADN asistido por superficie: una estrategia libre de enzimas hacia la formación de la red de ADN ramificado". Comunicaciones de investigación bioquímica y biofísica . 485 (2): 492–498. doi : 10.1016 / j.bbrc.2017.02.024 . PMID 28189681 . 
  16. ↑ a b c Shuman S (junio de 2009). "ADN ligasas: avances y perspectivas" . La Revista de Química Biológica . 284 (26): 17365–9. doi : 10.1074 / jbc.R900017200 . PMC 2719376 . PMID 19329793 .  
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  19. ^ "xeroderma pigmentosum" . Referencia casera de la genética . Consultado el 15 de mayo de 2017 .
  20. ^ "ataxia-telangiectasia" . Referencia casera de la genética . Consultado el 15 de mayo de 2017 .
  21. ^ "¿Qué es la anemia de Fanconi?" . NHLBI, NIH . Consultado el 15 de mayo de 2017 .
  22. ^ Tomkinson AE, Howes TR, Wiest NE (junio de 2013). "ADN ligasas como dianas terapéuticas" . Investigación traslacional del cáncer . 2 (3). PMC 3819426 . PMID 24224145 .  

Enlaces externos [ editar ]

  • DNA Ligase: molécula PDB del mes
  • Información general de Davidson College sobre Ligase
  • Protocolo de ligadura de ADN OpenWetWare
  • Descripción general de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P00970 (ADN ligasa) en el PDBe-KB .
  • Descripción general de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P18858 (ADN ligasa 1) en el PDBe-KB .
  • Descripción general de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P49916 (ADN ligasa 3) en el PDBe-KB .