La clonación de TOPO es una técnica de biología molecular en la que los fragmentos de ADN se clonan en vectores específicos sin el requisito de ADN ligasas . La polimerasa Taq tiene una actividad transferasa terminal no dependiente de la plantilla que añade una única desoxiadenosina (A) al extremo 3 'de los productos de la PCR. Esta característica se explota en la clonación de TOPO TA de "extremo pegajoso". [1] Para la clonación de TOPO de "extremos romos", el vector receptor no tiene voladizos y se pueden clonar fragmentos de ADN de extremos romos.
Principio
La técnica utiliza la actividad biológica inherente de la ADN topoisomerasa I. La función biológica de la topoisomerasa es escindir y volver a unir los extremos del ADN superenrollado para facilitar la replicación. La topoisomerasa I del virus vaccinia reconoce específicamente la secuencia de ADN 5´- (C / T) CCTT-3 '. Durante la replicación , la enzima digiere el ADN específicamente en esta secuencia, desenrolla el ADN y vuelve a ligarlo en el grupo fosfato 3 'de la base de timidina . [1]
Clonación de TOPO TA "Sticky end"
Los vectores TOPO están diseñados de tal manera que llevan esta secuencia específica 5´- (C / T) CCTT-3 'en los dos extremos lineales. El ADN del vector lineal ya tiene la enzima topoisomerasa unida covalentemente a los extremos 3 libres de sus dos cadenas. A continuación, se mezcla con productos de PCR. Cuando los extremos 5 'libres de las hebras del producto de PCR se unen al extremo 3' de la topoisomerasa de cada hebra del vector, las hebras se unen covalentemente por la topoisomerasa ya unida. Esta reacción procede de manera eficiente cuando esta solución se incuba a temperatura ambiente con la sal requerida. Se utilizan diferentes tipos de vectores para clonar fragmentos amplificados por la polimerasa Taq o Pfu, ya que la polimerasa Taq (a diferencia de Pfu) deja un nucleótido "A" adicional en el extremo 3 'durante la amplificación. [1]
La técnica de clonación TA TOPO se basa en la capacidad de la adenina (A) y la timina (T) (pares de bases complementarios) en diferentes fragmentos de ADN para hibridar y, en presencia de ligasa o topoisomerasa, unirse entre sí. El inserto se crea mediante PCR utilizando la ADN polimerasa Taq, una polimerasa que carece de actividad de corrección de pruebas de 3 'a 5' y, con una alta probabilidad, agrega un saliente único de 3'-adenina a cada extremo del producto de PCR. Es mejor si los cebadores de PCR tienen guaninas en el extremo 5 'ya que esto maximiza la probabilidad de que la ADN polimerasa Taq agregue el saliente terminal de adenosina. Las polimerasas termoestables que contienen una extensa actividad exonucleasa de 3´ a 5´ no deben usarse ya que no dejan los salientes de adenina 3´. El vector objetivo se linealiza y se corta con una enzima de restricción de extremos romos. A continuación, este vector se cola con trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) usando transferasa terminal. Es importante utilizar ddTTP para asegurar la adición de un solo residuo T. Esta cola deja el vector con un solo residuo de timina que sobresale 3 'en cada extremo romo. [1]
Clonación TOPO de "extremo contundente"
Las polimerasas (como Phusion) o las enzimas de restricción que producen extremos romos también se pueden usar para la clonación de TOPO. En lugar de depender de extremos pegajosos, el vector TOPO de extremos romos tiene extremos romos donde se unen las moléculas de topoisomerasa. Hay disponibles kits comerciales, como el kit de clonación Zero Blunt® de Invitrogen. [2]
Referencias
- ^ a b c d "La tecnología detrás de la clonación TOPO®" . Tecnologías de la vida . Consultado el 16 de julio de 2014 .
- ^ "Kits de clonación Zero Blunt®" . www.thermofisher.com .