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Un diagrama que muestra la estructura del plásmido Ti, con varias regiones importantes etiquetadas
La estructura del plásmido Ti

Un plásmido inductor de tumores (Ti) es un plásmido que se encuentra en especies patógenas de Agrobacterium , incluidas A. tumefaciens , A. rhizogenes , A. rubi y A. vitis .

Evolutivamente, el plásmido Ti es parte de una familia de plásmidos transportados por muchas especies de Alphaproteobacteria . Los miembros de esta familia de plásmidos se definen por la presencia de una región de ADN conservada conocida como casete del gen repABC , que media la replicación del plásmido, la partición del plásmido en células hijas durante la división celular , así como el mantenimiento del plásmido en números de copia bajos en una celda. [1] Los plásmidos Ti mismos se clasifican en diferentes categorías según el tipo de molécula, u opinan , permiten que las bacterias se descompongan como fuente de energía. [2]

La presencia de este plásmido Ti es esencial para que las bacterias causen la enfermedad de la agalla de la corona en las plantas. [1] Esto se facilita a través de ciertas regiones cruciales en el plásmido Ti, incluida la región vir , que codifica los genes de virulencia, y la región de transferencia de ADN (T-ADN), que es una sección del plásmido Ti que se transfiere mediante conjugación. en las células de la planta huésped después de que la bacteria detecta un sitio de lesión. Estas regiones tienen características que permiten el suministro de T-ADN a las células de la planta huésped y pueden modificar la célula de la planta huésped para provocar la síntesis de moléculas como hormonas vegetales (p. Ej. , Auxinas , citoquininas) y opina y la formación de tumores de la agalla de la corona. [1]

Debido a que la región de ADN-T del plásmido Ti se puede transferir de bacterias a células vegetales, representó una vía emocionante para la transferencia de ADN entre reinos y estimuló grandes cantidades de investigación sobre el plásmido Ti y sus posibles usos en bioingeniería.

Nomenclatura y clasificación [ editar ]

El plásmido Ti es un miembro de la familia de plásmidos RepABC que se encuentra en Alphaproteobacteria. [3] Estos plásmidos son a menudo de tamaño relativamente grande, que van desde 100 kpb a 2 Mbp. También se les suele denominar replicones , ya que su replicación comienza en un solo sitio. Los miembros de esta familia tienen un casete del gen repABC característico . [4] Otro miembro notable de esta familia es el plásmido inductor de raíces (Ri) transportado por A. rhizogenes , que causa otra enfermedad de las plantas conocida como enfermedad de la raíz pilosa. [1]

Una característica clave de los plásmidos Ti es su capacidad para impulsar la producción de opiniones, que son derivados de varios aminoácidos o fosfatos de azúcar , en las células de la planta huésped. Estas opiniones se pueden utilizar como un nutriente para las bacterias infectantes, lo que cataboliza las opiniones respectivas utilizando genes codificados en el plásmido Ti.

En consecuencia, los plásmidos Ti se han clasificado en función del tipo de opina que catabolizan, a saber: tipo nopalina , octopina o manitilo, que son derivados de aminoácidos, o tipo agrocinopina, que son derivados de fosfato de azúcar. [1]

Descubrimiento histórico [ editar ]

La identificación de A. tumefaciens como la causa de los tumores de agallas en las plantas allanó el camino para conocer las bases moleculares de la enfermedad de las agallas de la corona. [5]

La primera indicación de un efecto genético en las células de la planta huésped se produjo en 1942-1943, cuando se descubrió que las células vegetales de los tumores secundarios carecían de células bacterianas en su interior. Sin embargo, estas células tumorales poseían la capacidad de producir opiniones metabolizadas por la cepa bacteriana infectante. [6] Fundamentalmente, la producción de las respectivas opiniones se produjo independientemente de la especie de planta y ocasionalmente solo dentro de los tejidos de la agalla de la corona, lo que indica que las bacterias habían transferido algo de material genético a las células de la planta huésped para permitir la síntesis de opiniones. [5]

Sin embargo, sigue siendo una cuestión abierta cómo y en qué medida se produjo la transferencia de ADN. La adición de ADN de A. tumefaciens por sí sola no provocó tumores en las plantas, [7] mientras que se encontró que muy poco ADN de A. tumefaciens estaba integrado en el genoma de la célula de la planta huésped. [8] La adición de desoxirribonucleasas (DNasas) para degradar el ADN tampoco pudo prevenir la formación y el crecimiento de los tumores de las plantas. [9] Estos sugirieron que poco o nada del ADN de A. tumefaciens se transfiere a la célula de la planta huésped para causar enfermedad y, si el ADN se transfiere de la bacteria a la planta, debe ocurrir de manera protegida.

Posteriormente, se descubrió que las cepas de bacterias oncogénicas eran capaces de convertir bacterias no patógenas en patógenas mediante el proceso de conjugación, donde los genes responsables de la virulencia se transfirieron a las células no patógenas. [10] El papel de un plásmido en esta capacidad patógena se vio reforzado cuando se encontraron plásmidos grandes solo en bacterias patógenas pero no en bacterias avirulentas. [11] Finalmente, se estableció la detección de partes de plásmidos bacterianos en las células de la planta huésped, lo que confirmó que este era el material genético responsable del efecto genético de la infección. [12]

Con la identificación del plásmido Ti, se llevaron a cabo muchos estudios para determinar las características del plásmido Ti y cómo se transfiere el material genético de la Agrobacterium a la planta huésped. Algunos hitos tempranos notables en los estudios de plásmidos Ti incluyen el mapeo de un plásmido Ti en 1978 y el estudio de la similitud de secuencia entre diferentes plásmidos Ti en 1981. [13] [14]

Entre 1980 y 2000, también se llevó a cabo la caracterización de la región del ADN-T y la región 'vir'. Los estudios en la región del ADN-T determinaron su proceso de transferencia e identificaron genes que permitían la síntesis de hormonas vegetales y opiniones. [15] Por separado, el trabajo inicial tuvo como objetivo determinar las funciones de los genes codificados en la región 'vir'; estos se clasificaron ampliamente en aquellos que permitían interacciones bacteriano-huésped y aquellos que permitían la entrega de T-DNA. [2]

Replicación, particionamiento y mantenimiento [ editar ]

El casete del gen repABC de plásmidos Ti en Agrobacteria, con un esquema de su producto génico y actividades.

La replicación, partición y mantenimiento del plásmido Ti depende del casete del gen repABC , que se compone principalmente de tres genes: repA , repB y repC . repA y repB codifican proteínas involucradas en la partición de plásmidos, mientras que repC codifica un iniciador de replicación. [1] Estos genes se expresan a partir de 4 promotores diferentes ubicados corriente arriba de repA . repE codifica un pequeño ARN antisentido y está ubicado entre repB y repC . [4]Además, hay un sitio de partición ( parS ) y un origen de replicación ( oriV ) presentes dentro del casete repABC . [1]

Replicación del plásmido Ti [ editar ]

La replicación del plásmido Ti es impulsada por la proteína iniciadora RepC ( P05684 ), que posee dos dominios proteicos : un dominio N-terminal (NTD) que se une al ADN y un dominio C-terminal (CTD). Los análisis mutacionales han demostrado que sin una proteína RepC funcional, el plásmido Ti no puede replicarse. [4] Mientras tanto, la secuencia oriV tiene alrededor de 150 nucleótidos de longitud y se encuentra dentro del gen repC . [3] Los experimentos de laboratorio han demostrado que la proteína RepC se une a esta región, lo que sugiere su papel como origen de la replicación. [dieciséis]Por lo tanto, aunque el proceso completo detrás de la replicación del plásmido Ti no se ha descrito completamente, el paso inicial de replicación probablemente dependería de la expresión de RepC y su unión a oriV . Es de destacar que la proteína RepC solo actúa en cis , donde solo impulsa la replicación del plásmido en el que está codificado y no cualquier otro plásmido también presente en la célula bacteriana. [dieciséis]

Partición del plásmido Ti [ editar ]

Componentes involucrados en el sistema de partición RepA / RepB de plásmidos Ti [1]
ComponenteFunción
RepA (ParA), P05682Una ATPasa débil que autorregula negativamente la expresión del casete repABC y puede formar filamentos para ayudar en la partición del plásmido durante la división celular.
RepB (ParB), P05683Una proteína de unión al ADN que sirve como adaptador entre RepA y el sitio parS .
parSEl sitio de unión palindrómico para la proteína ParB; consensoGTTNNCNGCNGNNAAC

El sistema de partición del plásmido Ti es similar al sistema ParA / ParB utilizado en otros plásmidos y cromosomas bacterianos y se cree que actúa de la misma manera. [17] Las mutaciones en cualquiera de las proteínas RepA o RepB han dado como resultado una disminución en la estabilidad del plásmido, lo que indica su papel e importancia en la partición del plásmido. [4] La capacidad de RepA para formar filamentos le permite crear un puente físico a lo largo del cual el ADN se puede llevar a los polos opuestos de una célula en división. Mientras tanto, la proteína RepB puede unirse específicamente a la secuencia de parS , formando un complejo con ADN que puede ser reconocido por RepA. [1] [4] Este sistema es particularmente importante para la división adecuada del plásmido Ti, ya que el plásmido solo está presente en un número reducido de copias en la célula bacteriana.

Mantenimiento del plásmido Ti [ editar ]

El plásmido Ti se mantiene en un bajo número de copias dentro de una célula bacteriana. Esto se logra en parte influyendo en la expresión del iniciador de replicación RepC. [1] Cuando se une a ADP , RepA se activa para trabajar con RepB, ​​actuando como un regulador negativo del casete repABC . [3] Por lo tanto, los niveles de RepC se mantienen bajos dentro de una célula, evitando que ocurran demasiadas rondas de replicación durante cada ciclo de división celular. Además, existe un pequeño ARN conocido como RepE codificado entre repB y repC que reduce la expresión de repC . [18] RepE es complementarioa RepC y se unirá al ARNm de repC para formar una molécula de doble hebra. Esto puede bloquear la producción de traducción de la proteína RepC. [18]

Por separado, la expresión del casete repABC y, por tanto, el número de copias del plásmido Ti también se ve influido por un sistema de detección de quórum en Agrobacterium . [4] Los sistemas de detección de quórum responden a las densidades de población bacteriana detectando una molécula, conocida como autoinductora, que es producida por las células bacterianas en niveles bajos y que se acumularía hasta un nivel umbral cuando hay una alta densidad de bacterias presentes. [18] En este caso, el autoinductor es la molécula de lactona N-3-oxooctanoil-L-homoserina (3-OC 8 -AHL), que es detectada por un regulador conocido como TraR. [4] Cuando se activa, TraR se unirá a las regiones conocidas como tra boxes en elregiones promotoras del casete del gen repABC para impulsar la expresión. Por lo tanto, un alto nivel de densidad de población aumenta el número de plásmidos presentes dentro de cada célula bacteriana, probablemente para apoyar la patogénesis en la planta huésped. [4]

Funciones [ editar ]

Operón de virulencia [ editar ]

La composición de la región vir de plásmidos Ti de tipo octopina

La expresión de la región vir generalmente se reprime en condiciones normales y solo se activa cuando la bacteria detecta señales derivadas de plantas en los sitios de la herida. Esta activación es necesaria para la producción de proteínas Vir y la transferencia de ADN y proteínas a las células de la planta huésped. [1]

VirA y VirG forman un sistema regulador de dos componentes dentro de Agrobacterium . [19] Este es un tipo de sistema de detección y señalización que se encuentra comúnmente en las bacterias; en este caso, actúan para detectar señales derivadas de plantas para impulsar la expresión de la región vir . Durante la detección, VirA, una quinasa sensor de histidina, se fosforilará antes de pasar este grupo fosfato al regulador de respuesta VirG. [20] El regulador de respuesta activado VirG puede unirse a una región de ADN conocida como caja vir , ubicada corriente arriba de cada promotor vir , para activar la expresión de la región vir . [1][19] Una posible función posterior de la detección mediada por VirA y VirG es el movimiento direccional, o quimiotaxis , de las bacterias hacia señales derivadas de plantas; esto permite que Agrobacterium se mueva hacia el sitio de la herida en las plantas. [21] Además, con la inducción de laregión vir , la transferencia de ADN-T puede ser mediada por las proteínas Vir. [22]

El operón virB es el operón más grande en la región vir , codificando 11 proteínas VirB involucradas en el proceso de transferencia de T-ADN y proteínas bacterianas a las células de la planta huésped (ver aparato de transferencia a continuación). [23] [24]

El operón virC codifica dos proteínas: VirC1 y VirC2. Estas proteínas influyen en la patogénesis de Agrobacterium hacia diferentes plantas hospedantes, y las mutaciones pueden reducir, pero no eliminar, la virulencia de las bacterias. [25] Tanto los operones virC como virD pueden ser reprimidos por una proteína codificada cromosómicamente conocida como Ros. [26] [27] Ros se une a una región de ADN que se superpone con el sitio de unión del regulador VirG y, por lo tanto, compite con VirG para controlar sus niveles de expresión. [26] [27] Funcionalmente, VirC1 y VirC2 promueven el ensamblaje de un relaxosomacomplejo durante la transferencia conjugativa de T-ADN de la bacteria a la célula de la planta huésped. [28] Este es un proceso dependiente de la energía mediado a través de su actividad NTPasa, y ocurre cuando se unen a una región de ADN conocida como overdrive . [28] Como resultado, actúan para aumentar la cantidad de hebras de ADN-T producidas. Después de la producción de la hebra de ADN que se va a transferir (hebra de transferencia, hebra T), las proteínas VirC también pueden ayudar a dirigir la hebra de transferencia al aparato de transferencia. [28]

El operón virD codifica 4 proteínas: VirD1-D4. [29] VirD1 y VirD2 están involucrados en el procesamiento de T-DNA durante la conjugación para producir la cadena T; esta es la molécula de ADN monocatenario que se transporta a la célula de la planta huésped (ver el aparato de transferencia a continuación). [30] Durante el procesamiento, VirD1 actuará como una topoisomerasa para desenrollar las hebras de ADN. [30] VirD2, una relaxasa , luego cortará una de las hebras de ADN y permanecerá unida al ADN mientras se transfiere a la célula receptora. [31] [32]Dentro de la célula receptora, VirD2 también trabajará junto con VirE2 para dirigir el ADN transferido al núcleo de la célula receptora. Hay sugerencias de que VirD2 puede ser fosforilada y desfosforilada por diferentes proteínas, lo que afecta su capacidad para administrar ADN. [33] Por el contrario, se sabe poco sobre VirD3, y los análisis mutacionales no han proporcionado ningún apoyo para su papel en la virulencia de Agrobacterium . [34] Finalmente, VirD4 es una parte crucial del proceso de conjugación, que sirve como factor de acoplamiento que reconoce y transfiere la hebra T al canal de transporte. [35]

El operón virE codifica 2 proteínas: VirE1 y VirE2. [36] VirE2 es una proteína efectora translocada junto con la hebra T en las células de la planta huésped. Allí, se une a la hebra T para dirigir su suministro al núcleo de la célula de la planta huésped. [37] [38] Parte de esta actividad implica la presencia de secuencias de localización nuclear dentro de la proteína, que marca la proteína y el ADN asociado para entrar en el núcleo. También protege la hebra T del ataque de nucleasas . [39] Existe cierta especulación con respecto al papel de VirE2 como un canal de proteínas, lo que permite que el ADN se mueva a través de la membrana citoplasmática de la planta .[40] Por otro lado, VirE1 puede participar en la promoción de la transferencia de la proteína VirE2 a la célula de la planta huésped. [41] Se une al dominio de unión del ssDNA de VirE2, por lo que evita que la proteína VirE2 se una prematuramente a la hebra T dentro de la célula bacteriana. [42]

virF es un factor de especificidad del huésped que se encuentra en algunos tipos de plásmidos Ti, pero no en todos; por ejemplo, los plásmidos Ti de tipo octopina poseen virF pero los de tipo nopalina no. [43] [44] La capacidad de A. tumefaciens para inducir tumores de agallas en la corona en ciertas especies de plantas, pero no en otras, se ha atribuido a la presencia o ausencia de este gen virF . [43] [44]

El operón virH codifica 2 proteínas: VirH1 y VirH2. [45] Un estudio bioinformático de las secuencias de aminoácidos de la proteína VirH mostró similitudes entre ellas y una superfamilia de proteínas conocidas como enzimas del citocromo P450 . [46] Luego se descubrió que VirH2 metaboliza ciertos compuestos fenólicos detectados por VirA. [45]

Transferir ADN (T-ADN) [ editar ]

El T-ADN de Agrobacterium tiene aproximadamente 15-20 kpb de longitud y se integrará en el genoma de la planta huésped tras su transferencia mediante un proceso conocido como recombinación . Este proceso utiliza brechas preexistentes en el genoma de la célula de la planta huésped para permitir que el ADN-T se empareje con secuencias cortas en el genoma, iniciando el proceso de ligación del ADN , donde el ADN-T se une permanentemente al genoma de la planta. [37] La región de T-DNA está flanqueada en ambos extremos por secuencias de 24 pb.

Dentro del genoma de la célula de la planta huésped, el ADN-T de Agrobacterium se expresa para producir dos grupos principales de proteínas. [1] Un grupo es responsable de la producción de hormonas de crecimiento vegetal. A medida que se produzcan estas hormonas, habrá un aumento en la tasa de división celular y, por lo tanto, la formación de tumores de agallas de la corona. [47] El segundo grupo de proteínas es responsable de impulsar la síntesis de opiniones en las células de la planta huésped. Las opiniones específicas producidas dependen del tipo de plásmido Ti pero no de la planta huésped. Estas opiniones no pueden ser utilizadas por la planta huésped y, en cambio, serán exportadas fuera de la célula vegetal donde puede ser absorbida por Agrobacterium.células. Las bacterias poseen genes en otras regiones del plásmido Ti que permiten el catabolismo de opiniones. [1]

Aparato de transferencia [ editar ]

Los aparatos de transferencia codificados dentro del plásmido Ti deben lograr dos objetivos: permitir la transferencia conjugativa del plásmido Ti entre bacterias y permitir la entrega del ADN-T y ciertas proteínas efectoras en las células de la planta huésped. Estos se logran mediante el sistema Tra / Trb y el sistema VirB / VirD4 respectivamente, que son miembros del sistema de secreción de tipo IV (T4SS). [47]

Para que el plásmido Ti y el ADN-T se transfieran por conjugación, primero deben ser procesados ​​por diferentes proteínas, como la enzima relaxasa (TraA / VirD2) y las proteínas de transferencia y replicación del ADN (Dtr). Juntas, estas proteínas reconocerán y se unirán a una región conocida como origen de transferencia ( oriT ) en el plásmido Ti para formar el complejo de relaxosoma. Para el T-DNA, se creará una muesca en la secuencia del borde del T-DNA, y la hebra T cortada se transportará a la membrana celular, donde está presente el resto de la maquinaria de transferencia. [31]

Dentro del sistema VirB / VirD4, la relaxasa VirD2 es ayudada por los factores accesorios VirD1, VirC1 y VirC2 mientras procesa el sustrato de ADN. [48] Además, la relaxasa VirD2 y las proteínas VirC contribuirán a la entrega de la cadena de ADN al receptor VirD4 en la membrana celular. [28] Este receptor es un componente esencial de las T4SS y se cree que activa y media la transferencia del ADN al canal de translocación entre dos células. [49] La siguiente tabla resume las proteínas codificadas en el operón virB que forma el canal de translocación del sistema VirB / VirD4. [1]

Proteína (s)Función
VirB4, VirB11ATPasas que proporcionan la energía para la transferencia de ADN [50] [51]
VirB3, VirB6, VirB8Subunidades de una supuesta translocasa de membrana interna [50] [52] [53]
VirB7, VirB9, VirB10Forma un complejo central que estabiliza las subunidades del canal [50] [54]
VirB2La principal subunidad pilina del pilus conjugativo [50]
VirB1, VirB5Componentes menores del pilus conjugativo [55] [56]

Usos en bioingeniería [ editar ]

Ver también: Agrobacterium tumefaciens

La capacidad de Agrobacterium para entregar ADN en células vegetales abrió nuevas puertas para la ingeniería del genoma vegetal , permitiendo la producción de plantas modificadas genéticamente (plantas transgénicas). [57] Las proteínas implicadas en la mediación de la transferencia de T-DNA reconocerán primero las secuencias fronterizas de la región de T-DNA. Por lo tanto, es posible que los científicos utilicen secuencias de borde de ADN-T para flanquear cualquier secuencia de interés deseada; este producto puede luego insertarse en un plásmido e introducirse en células de Agrobacterium . [58] Allí, las secuencias fronterizas serán reconocidas por el aparato de transferencia de A. tumefaciens.y se administra de manera estándar en la célula vegetal objetivo. [1] Además, al dejar solo las secuencias fronterizas del ADN-T, el producto resultante editará el genoma de la planta sin causar tumores en las plantas. [59] Este método se ha utilizado para modificar varias plantas de cultivo, como arroz, [60] cebada [61] y trigo. [62] Desde entonces, trabajos posteriores han ampliado los objetivos de A. tumefaciens para incluir hongos y líneas celulares humanas. [63] [64]

Ver también [ editar ]

  • Mary-Dell Chilton
  • Jeff Schell
  • Marc Van Montagu

Referencias [ editar ]

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Enlaces externos [ editar ]

  • Plásmido pTi-SAKURA de Agrobacterium tumefaciens, secuencia completa
  • Mapa genético del plásmido Ti
  • Enfermedad de la agalla de la corona