Aequorin es una fotoproteína activada por calcio aislada del hidrozoo Aequorea victoria . [1] Aunque la bioluminiscencia se estudió décadas antes, la proteína fue aislada en 1962 del animal por Osamu Shimomura . [2] En los animales, la proteína se produce junto con la proteína verde fluorescente para producir luz verde por transferencia de energía resonante , mientras que la aequorina por sí misma genera luz azul.
Aequorin 1 | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | N / A | |||||
UniProt | P07164 | |||||
Otros datos | ||||||
Número CE | 1.13.12.5 | |||||
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Las discusiones sobre el "ADN de las medusas" para hacer animales "brillantes" a menudo se refieren a animales transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente, no la aecuorina, aunque ambos derivan originalmente del mismo animal.
La apoaequorina, la porción proteica de la aequorina, es un ingrediente del suplemento dietético Prevagen. La Comisión Federal de Comercio de EE. UU. (FTC) ha acusado al fabricante de publicidad falsa por sus afirmaciones de mejora de la memoria.
Descubrimiento
El trabajo en la aequorina comenzó con E. Newton Harvey en 1921. [3] Aunque Harvey no pudo demostrar una reacción clásica de luciferasa - luciferina , demostró que el agua podía producir luz a partir de fotocitos secos y que la luz podía producirse incluso en ausencia de oxígeno. . Más tarde, Osamu Shimomura comenzó a trabajar en la bioluminiscencia de Aequorea en 1961. Esto implicó la tediosa recolección de decenas de miles de medusas en los muelles de Friday Harbor, Washington . [1] Se determinó que la luz podría producirse a partir de extractos con agua de mar y, más específicamente, con calcio . [2] También se observó durante la extracción que el animal crea luz verde debido a la presencia de la proteína verde fluorescente , que cambia la luz azul nativa de la aecuorina a verde. [4]
Si bien el enfoque principal de su trabajo fue la bioluminiscencia, [5] Shimomura y otros dos, Martin Chalfie y Roger Tsien , fueron galardonados con el Premio Nobel en 2008 por su trabajo sobre proteínas fluorescentes verdes .
Estructura
La aecuorina es una holoproteína compuesta por dos unidades distintas, la apoproteína que se llama apoaequorina , que tiene un peso molecular aproximado de 21 kDa , y el grupo protésico coelenterazina , la luciferina. [6] Es decir, la apoaequorina es la enzima producida en los fotocitos del animal, y la coelenterazina es el sustrato cuya oxidación cataliza la enzima. Cuando se une coelenterazine, se llama aequorin. En particular, la proteína contiene tres motivos de mano EF que funcionan como sitios de unión para los iones Ca 2+ . [7] La proteína es un miembro de la superfamilia de proteínas que se unen al calcio, de las cuales hay unas 66 subfamilias. [8]
La estructura cristalina reveló que la aequorina se une a coelenterazina y oxígeno en forma de peróxido , coelenterazina-2-hidroperóxido. [9] El sitio de unión de los dos primeros átomos de calcio muestra una afinidad 20 veces mayor por el calcio que el tercer sitio. [10] Sin embargo, las afirmaciones anteriores de que solo dos manos EF se unen al calcio, [11] fueron cuestionadas cuando las estructuras posteriores indicaron que los tres sitios de hecho pueden unirse al calcio. [12] Por lo tanto, los estudios de titulación muestran que los tres sitios de unión al calcio están activos, pero solo se necesitan dos iones para desencadenar la reacción enzimática. [13]
Otros estudios han demostrado la presencia de un enlace de cisteína interno que mantiene la estructura de la aecuorina. [14] Esto también ha explicado la necesidad de un reactivo tiol como el beta mercaptoetanol en la regeneración de la proteína, ya que tales reactivos debilitan los enlaces sulfhidrilo entre los residuos de cisteína , acelerando la regeneración de la aecuorina.
La caracterización química de la aequorina indica que la proteína es algo resistente a los tratamientos severos. Aequorin es resistente al calor. [15] Mantenida a 95 ° C durante 2 minutos, la proteína perdió solo un 25% de actividad. Los desnaturalizantes 6M-urea o 4M-guanidina clorhidrato no destruyeron la proteína.
Genética
Se presume que la aequorina está codificada en el genoma de Aequorea. Se recuperaron al menos cuatro copias del gen como ADNc del animal. [16] [17] Debido a que el genoma no ha sido secuenciado, no está claro si las variantes de cDNA pueden explicar todas las isoformas de la proteína. [18]
Mecanismo de acción
Los primeros estudios de la bioluminiscencia de Aequorea por E. Newton Harvey habían notado que la bioluminiscencia aparece como un anillo alrededor de la campana y ocurre incluso en ausencia de aire. [19] Esto fue notable porque la mayoría de las reacciones de bioluminiscencia parecían requerir oxígeno y llevó a la idea de que los animales almacenan oxígeno de alguna manera. [20] Más tarde se descubrió que la apoproteína puede unirse de manera estable a la coelenterazina y se requiere oxígeno para la regeneración de la forma activa de la aequorina. [21] Sin embargo, en presencia de iones de calcio , la proteína sufre un cambio conformacional y, a través de la oxidación, convierte su grupo protésico, coelenterazina , en coelenteramida excitada y CO 2 . [22] A medida que la coelenteramida excitada se relaja al estado fundamental, se emite luz azul ( longitud de onda de 465 nm). Antes de que se intercambie la coelenteramida, toda la proteína sigue siendo azul fluorescente. [23] [24] Debido a la conexión entre bioluminiscencia y fluorescencia , esta propiedad fue en última instancia importante en el descubrimiento de la luciferina coelenterazina . [25]
Aplicaciones
Dado que la luz emitida se puede detectar fácilmente con un luminómetro , la aequorina se ha convertido en una herramienta útil en biología molecular para la medición de los niveles de Ca 2+ intracelular . [26] La purificación temprana y exitosa de la aequorina condujo a los primeros experimentos que involucraron la inyección de la proteína en los tejidos de animales vivos para visualizar la liberación fisiológica de calcio en las fibras musculares de un percebe. [27] Desde entonces, la proteína se ha utilizado ampliamente, como se informó en muchos modelos de sistemas biológicos , incluidos el pez cebra , [28] ratas , ratones y células cultivadas . [29] [30] [31] [32]
Las células cultivadas que expresan el gen de la aequorina pueden sintetizar eficazmente la apoaequorina: sin embargo, la expresión recombinante produce solo la apoproteína , por lo tanto, es necesario agregar coelenterazina al medio de cultivo de las células para obtener una proteína funcional y, por lo tanto, usar su emisión de luz azul para medir Ca 2 + concentración. La coelenterazina es una molécula hidrófoba y, por lo tanto, se absorbe fácilmente a través de las paredes celulares de las plantas y los hongos , así como la membrana plasmática de los eucariotas superiores, lo que hace que la aecuorina sea adecuada como un ( indicador de Ca 2+ ) en plantas, hongos y células de mamíferos. [33] [34]
La aequorina tiene una serie de ventajas sobre otros indicadores de Ca 2+ : debido a que la proteína es grande, tiene una baja tasa de fuga de las células en comparación con los colorantes lipofílicos como DiI . Carece de fenómenos de compartimentación o secuestro intracelular, como se ve a menudo con los tintes sensibles al voltaje , y no interrumpe las funciones celulares o el desarrollo embrionario. Además, la luz emitida por la oxidación de coelenterazina no depende de ninguna excitación óptica, por lo que se eliminan los problemas de autofluorescencia. [35] La principal limitación de la aequorina es que el grupo protésico coelenterazina se consume irreversiblemente para producir luz y requiere la adición continua de coelenterazina en el medio. Tales problemas llevaron al desarrollo de otros sensores de calcio codificados genéticamente, incluido el sensor cameleon basado en calmodulina , [36] desarrollado por Roger Tsien y el sensor basado en troponina , TN-XXL , desarrollado por Oliver Griesbeck. [37]
Márketing
La apoaequorina es un ingrediente de "Prevagen", que Quincy Bioscience comercializa como un suplemento para la memoria. La Comisión Federal de Comercio de EE. UU. (FTC) acusó al fabricante de anunciar falsamente que el producto mejora la memoria, proporciona beneficios cognitivos y está "clínicamente demostrado" que funciona. Según la FTC, "los especialistas en marketing de Prevagen aprovecharon los temores de los consumidores mayores que experimentan pérdida de memoria relacionada con la edad ". Quincy dijo que lucharía contra los cargos. [38] [39] [40]
Antes de la demanda, un ensayo clínico realizado por investigadores empleados por Quincy Bioscience "no encontró ningún beneficio general en comparación con un placebo para sus criterios de valoración primarios relacionados con la memoria y la cognición", mientras que la publicidad de la compañía citaba engañosamente algunos análisis de subgrupos controvertidos que mostraban leves mejoras. [41] [42]
La demanda ( Spath y otros contra Quincy Bioscience Holding Company, Inc. y otros , caso núm. 18-cv-12416, D. NJ.) Fue desestimada en el tribunal de distrito, pero se presentó una apelación para anular el despido . La demanda se consolidó con otra contra Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Caso No. 17-cv-784, D. NJ), que fue el caso principal. [43]
El 21 de febrero de 2019, la Corte de Apelaciones del Segundo Circuito de los Estados Unidos dictaminó que la FTC y el estado de Nueva York podrían proceder con su demanda contra Quincy Bioscience por sus afirmaciones de que Prevagen puede mejorar la memoria. La orden se produjo menos de dos semanas después de que las partes argumentaron el caso ante un panel de tres jueces del circuito, donde los abogados de la empresa admitieron que no "disputaron que si se mira a las 211 personas que completaron el estudio, no hubo estadísticas diferencia". El tribunal desestimó enérgicamente las acusaciones de los abogados de la empresa de que la FTC prosiguió su acción por razones políticas. [44] [45]
El 23 de marzo de 2020, un magistrado federal del Tribunal de Distrito de los Estados Unidos para el Distrito Sur de Florida presentó un informe y recomendaciones que certifican una demanda colectiva a nivel nacional para la clase de consumidores que compraron Prevagen durante los cuatro años anteriores. [46] El juicio en el caso está programado para octubre de 2020. [46] [47]
La Dra. Harriet Hall , que escribe para Science-Based Medicine , señala que el estudio patrocinado por Quincy (conocido como "Estudio de la memoria de Madison") fue negativo, pero que la compañía utilizó p-hacking para encontrar resultados favorables. Ella señala que los estudios de seguridad citados son todos estudios en ratas y su afirmación de que la apoaequorina cruza la barrera hematoencefálica se basa únicamente en un estudio con perros. [48] La Asociación Estadounidense de Farmacéuticos advierte que la apoaequorina "es poco probable que se absorba en un grado significativo; en cambio, se degrada en aminoácidos". [49]
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enlaces externos
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