Las moléculas de Affimer [1] son proteínas pequeñas que se unen a proteínas diana con afinidad en el rango nanomolar. [2] [3] Estas proteínas de unión que no se unen a anticuerpos están diseñadas para imitar las características de reconocimiento molecular de los anticuerpos monoclonales en diferentes aplicaciones. [2] [4] Estos reactivos de afinidad se han optimizado para aumentar su estabilidad, [5] hacerlos tolerantes a un rango de temperaturas y pH, [6] reducir su tamaño y aumentar su expresión en E.coli y células de mamíferos . [2]
Las proteínas Affimer se desarrollaron inicialmente en la Unidad de células cancerosas del MRC en Cambridge y luego en dos laboratorios de la Universidad de Leeds . [7] [8] [9] [10] Derivadas de la familia de inhibidores de la cisteína proteasa de las cistatinas , que funcionan en la naturaleza como inhibidores de la cisteína proteasa, [11] [12] estas proteínas de 12–14 kDa comparten la estructura terciaria común de un hélice alfa sobre una lámina beta antiparalela . [13]
Las proteínas afímeras muestran dos bucles peptídicos que pueden aleatorizarse para unirse a las proteínas diana deseadas, [5] de manera similar a los anticuerpos monoclonales . La estabilización de los dos péptidos por el andamiaje proteico restringe las posibles conformaciones que pueden tomar los péptidos. Esto aumenta la afinidad y la especificidad de unión en comparación con las bibliotecas de péptidos libres, aunque puede limitar el repertorio objetivo de Affimers.
Las bibliotecas de presentación de fagos de 10 9 secuencias aleatorias [14] se utilizan para detectar proteínas Affimer que exhiben una alta especificidad de unión a la proteína diana con afinidades de unión en el rango de nM . [5] [15] [16] La capacidad de dirigir técnicas de detección in vitro permite la identificación de Affimers específicos de alta afinidad. La selección y el desarrollo in vitro también significan que el espacio objetivo de Affimers no está limitado por el sistema inmunitario del animal . Los affimers se generan mediante sistemas recombinantes, por lo que su generación es más rápida y reproducible en comparación con la producción de anticuerpos policlonales .[17]
Se han generado formas multiméricas de Affimers y se ha demostrado que producen títulos en el rango de 200 a 400 mg/l en cultivos a pequeña escala utilizando sistemas hospedadores bacterianos. Las formas multiméricas de Affimers con la misma especificidad de objetivo proporcionan efectos de avidez en la unión al objetivo.
Muchas etiquetas y proteínas de fusión diferentes, como fluoróforos , etiquetas de ADN monocatenario, His y c-Myc , se pueden conjugar con Affimers. [2] [18] [19] [20] [21] [22] Se pueden introducir residuos de cisteína específicos en la proteína para permitir que la química del tiol oriente uniformemente los Affimers en un soporte sólido, por ejemplo, placas ELISA. [5] [15] [17] [23] [24] Esta funcionalización flexible de la molécula Affimer permite la funcionalidad en múltiples aplicaciones y formatos de ensayo.