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Ciclo de presentación de fagos. 1) las proteínas de fusión para una proteína de la cubierta viral + el gen a desarrollar (típicamente un fragmento de anticuerpo) se expresan en bacteriófagos. 2) la biblioteca de fagos se lava sobre una diana inmovilizada. 3) los aglutinantes de alta afinidad restantes se utilizan para infectar bacterias. 4) se aíslan los genes que codifican los ligantes de alta afinidad. 5) esos genes pueden tener mutaciones aleatorias introducidas y utilizadas para realizar otra ronda de evolución. Las etapas de selección y amplificación se pueden realizar varias veces con mayor rigor para aislar aglutinantes de mayor afinidad.

La exhibición de fagos es una técnica de laboratorio para el estudio de interacciones proteína-proteína , proteína - péptido y proteína- ADN que utiliza bacteriófagos ( virus que infectan bacterias ) para conectar proteínas con la información genética que las codifica . [1] En esta técnica, un gen que codifica una proteína de interés se inserta en un gen de la proteína de la cubierta del fago , lo que hace que el fago "muestre" la proteína en su exterior mientras contiene el gen de la proteína en su interior, lo que resulta en una conexión entre genotipo yfenotipo . A continuación, estos fagos de presentación pueden cribarse frente a otras proteínas, péptidos o secuencias de ADN, para detectar la interacción entre la proteína presentada y esas otras moléculas. De esta manera, se pueden cribar y amplificar grandes bibliotecas de proteínas en un proceso llamado selección in vitro , que es análogo a la selección natural .

Los bacteriófagos más comunes utilizados en la presentación en fagos son M13 y fd fago filamentoso , [2] [3] aunque T4 , [4] T7 , y λ fago también se han utilizado.

Historia [ editar ]

La presentación de fagos fue descrita por primera vez por George P. Smith en 1985, cuando demostró la presentación de péptidos en fagos filamentosos (virus largos y delgados que infectan bacterias) fusionando la proteína de la cápside del virus con un péptido de una colección de secuencias de péptidos. [1] Esto mostró los diferentes péptidos en las superficies externas de la colección de clones virales, donde el paso de selección del proceso aisló los péptidos con la mayor afinidad de unión. En 1988, Stephen Parmley y George Smith describieron el biopanning para la selección por afinidad y demostraron que las rondas recursivas de selección podrían enriquecer los clones presentes en 1 en mil millones o menos.[5] En 1990, Jamie Scott y George Smith describieron la creación de grandes bibliotecas de péptidos aleatorios mostradas en fagos filamentosos. [6] La tecnología de visualización de fagos fue desarrollada y mejorada por grupos en el Laboratorio de Biología Molecular con Greg Winter y John McCafferty , el Instituto de Investigación Scripps con Richard Lerner y Carlos Barbas y el Centro Alemán de Investigación del Cáncer con Frank Breitling y Stefan Dübel para exhibición. de proteínas como anticuerpos para la ingeniería de proteínas terapéuticas . Smith y Winter recibieron la mitad del premio Nobel de química 2018 por su contribución al desarrollo de la exhibición de fagos. [7] Una patente de George Pieczenik que reivindica la prioridad de 1985 también describe la generación de bibliotecas de péptidos. [8]

Principio [ editar ]

Al igual que el sistema de dos híbridos , la presentación de fagos se utiliza para el cribado de alto rendimiento de interacciones de proteínas. En el caso de la presentación de fagos filamentosos M13 , el ADN que codifica la proteína o péptido de interés se liga en el gen pIII o pVIII, que codifica la proteína de la cubierta menor o mayor , respectivamente. A veces se utilizan múltiples sitios de clonación para asegurar que los fragmentos se inserten en los tres posibles marcos de lectura de modo que el fragmento de ADNc se traduzca en el marco adecuado. El gen del fago y el inserto de ADN híbrido se insertan (un proceso conocido como " transducción ") enCélulas bacterianas de E. coli como TG1, SS320, ER2738 o XL1-Blue E. coli . Sise utiliza un vector " fagémido "(un vector de construcción de presentación simplificada), las partículas de fago no se liberarán de lascélulas de E. coli hasta que se infecten con el fago auxiliar , lo que permite el empaquetamiento del ADN del fago y el ensamblaje de los viriones maduroscon el fragmento de proteína relevante como parte de su recubrimiento externo en la proteína de recubrimiento menor (pIII) o mayor (pVIII). Inmovilizando un objetivo de ADN o proteína relevante en la superficie de una placa de microtitulaciónbueno, un fago que muestra una proteína que se une a uno de esos objetivos en su superficie permanecerá mientras otros se eliminan mediante el lavado. Los que quedan pueden eluirse , usarse para producir más fagos (por infección bacteriana con fagos auxiliares) y para producir una mezcla de fagos enriquecida con fagos relevantes (es decir, de unión). El ciclo repetido de estos pasos se conoce como "cribado" , en referencia al enriquecimiento de una muestra de oro mediante la eliminación de materiales indeseables. El fago eluido en el paso final puede usarse para infectar un huésped bacteriano adecuado, del cual se pueden recolectar los fagémidos y la secuencia de ADN relevante escindida y secuenciada para identificar las proteínas o fragmentos de proteína que interactúan relevantes.

El uso de un fago auxiliar puede eliminarse utilizando la tecnología de "línea celular de empaquetamiento bacteriano". [9]

La elución se puede realizar combinando tampón de elución de pH bajo con sonificación, que, además de aflojar la interacción péptido-diana, también sirve para separar la molécula diana de la superficie de inmovilización. Este método basado en ultrasonidos permite la selección en un solo paso de un péptido de alta afinidad. [10]

Aplicaciones [ editar ]

Las aplicaciones de la tecnología de presentación de fagos incluyen la determinación de los compañeros de interacción de una proteína (que se utilizaría como el "cebo" del fago inmovilizado con una biblioteca de ADN que consta de todas las secuencias codificantes de una célula, tejido u organismo) de modo que la función o el mecanismo de se puede determinar la función de esa proteína. [11] La exhibición de fagos es también un método ampliamente utilizado para la evolución de proteínas in vitro (también llamado ingeniería de proteínas ). Como tal, la presentación de fagos es una herramienta útil en el descubrimiento de fármacos . Se utiliza para encontrar nuevos ligandos (inhibidores de enzimas, agonistas de receptores y antagonistas) para las proteínas diana. [12] [13] [14]La técnica también se utiliza para determinar antígenos tumorales (para su uso en el diagnóstico y la orientación terapéutica) [15] y en la búsqueda de interacciones proteína-ADN [16] utilizando bibliotecas de ADN especialmente construidas con segmentos aleatorizados. Recientemente, la exhibición de fagos también se ha utilizado en el contexto de tratamientos contra el cáncer, como el enfoque de transferencia celular adoptiva. [17] En estos casos, la presentación de fagos se utiliza para crear y seleccionar anticuerpos sintéticos que se dirigen a las proteínas de la superficie del tumor. [17] Estos se convierten en receptores sintéticos para células T recolectadas del paciente que se utilizan para combatir la enfermedad. [18]

Métodos que compiten por in vitro evolución de proteínas incluyen presentación en levadura , pantalla bacteriana , presentación de ribosomas , y pantalla mRNA .

Maduración de anticuerpos in vitro [ editar ]

La invención de la presentación de anticuerpos en fagos revolucionó el descubrimiento de fármacos de anticuerpos. El trabajo inicial fue realizado por los laboratorios del Laboratorio de Biología Molecular del MRC ( Greg Winter y John McCafferty ), el Instituto de Investigación Scripps (Richard Lerner y Carlos F. Barbas) y el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (Frank Breitling y Stefan Dübel). [19] [20] [21] En 1991, el grupo Scripps informó sobre la primera presentación y selección de anticuerpos humanos en fagos. [22] Este estudio inicial describió el rápido aislamiento del anticuerpo humano Fab que se une a la toxina del tétanosy el método se extendió luego para clonar rápidamente anticuerpos humanos anti-VIH-1 para el diseño y la terapia de vacunas. [23] [24] [25] [26] [27]

La exhibición de fagos de bibliotecas de anticuerpos se ha convertido en un método poderoso tanto para estudiar la respuesta inmune como para seleccionar y desarrollar rápidamente anticuerpos humanos para la terapia. La presentación de anticuerpos en fagos fue utilizada más tarde por Carlos F.Barbas en el Instituto de Investigación Scripps para crear bibliotecas de anticuerpos humanos sintéticos, un principio patentado por primera vez en 1990 por Breitling y colaboradores (patente CA 2035384), lo que permite la creación in vitro de anticuerpos humanos a partir de anticuerpos sintéticos. elementos de diversidad. [28] [29] [30] [31]

Las bibliotecas de anticuerpos que muestran millones de anticuerpos diferentes en fagos se utilizan a menudo en la industria farmacéutica para aislar conductores de anticuerpos terapéuticos altamente específicos, para su desarrollo en fármacos de anticuerpos principalmente como agentes terapéuticos contra el cáncer o antiinflamatorios. Uno de los más exitosos fue el adalimumab , descubierto por Cambridge Antibody Technology como D2E7 y desarrollado y comercializado por Abbott Laboratories . El adalimumab, un anticuerpo contra el TNF alfa , fue el primer anticuerpo completamente humano del mundo, [32] que logró ventas anuales superiores a los mil millones de dólares. [33]

Protocolo general [ editar ]

A continuación se muestra la secuencia de eventos que se siguen en el cribado de presentación de fagos para identificar polipéptidos que se unen con alta afinidad a la proteína o secuencia de ADN deseada:

  1. Las proteínas diana o las secuencias de ADN se inmovilizan en los pocillos de una placa de microvaloración .
  2. Muchas secuencias genéticas se expresan en una biblioteca de bacteriófagos en forma de fusiones con la proteína de la cubierta del bacteriófago, de modo que se muestran en la superficie de la partícula viral. La proteína mostrada corresponde a la secuencia genética dentro del fago.
  3. Esta biblioteca de presentación de fagos se agrega a la placa y, después de permitir que el fago se una, se lava la placa.
  4. Las proteínas que muestran los fagos que interactúan con las moléculas diana permanecen adheridas a la placa, mientras que todas las demás se eliminan por lavado.
  5. Los fagos unidos pueden eluirse y usarse para crear más fagos mediante la infección de huéspedes bacterianos adecuados. El nuevo fago constituye una mezcla enriquecida que contiene considerablemente menos fagos irrelevantes (es decir, que no se unen) que los presentes en la mezcla inicial.
  6. Los pasos 3 a 5 se repiten opcionalmente una o más veces, enriqueciendo aún más la biblioteca de fagos en proteínas de unión.
  7. Después de una mayor amplificación basada en bacterias, el ADN dentro del fago que interactúa se secuencia para identificar las proteínas o fragmentos de proteínas que interactúan.

Selección de la proteína de la cubierta [ editar ]

Fagos filamentosos [ editar ]

pIII [ editar ]

pIII es la proteína que determina la infectividad del virión. pIII se compone de tres dominios (N1, N2 y CT) conectados por enlazadores ricos en glicina. [34] El dominio N2 se une al pilus F durante la infección por virión, liberando el dominio N1 que luego interactúa con una proteína TolA en la superficie de la bacteria. [34] Las inserciones dentro de esta proteína generalmente se agregan en la posición 249 (dentro de una región enlazadora entre CT y N2), en la posición 198 (dentro del dominio N2) y en el N-terminal (insertado entre la secuencia de secreción N-terminal y la N -terminus de pIII). [34]Sin embargo, cuando se usa el sitio BamHI ubicado en la posición 198, se debe tener cuidado con el residuo de cisteína no apareado (C201) que podría causar problemas durante la presentación de fagos si se usa una versión no truncada de pIII. [34]

Una ventaja de usar pIII en lugar de pVIII es que pIII permite la presentación monovalente cuando se usa un fagémido (plásmido derivado del fago Ff) combinado con un fago auxiliar. Además, pIII permite la inserción de secuencias de proteínas más grandes (> 100 aminoácidos) [35] y es más tolerante que pVIII. Sin embargo, el uso de pIII como socio de fusión puede conducir a una disminución de la infectividad del fago que conduce a problemas como el sesgo de selección causado por la diferencia en la tasa de crecimiento del fago [36] o, lo que es peor, la incapacidad del fago para infectar a su huésped. [34] La pérdida de la infectividad del fago puede evitarse utilizando un plásmido fagémido y un fago auxiliar de modo que el fago resultante contenga tanto el pIII de tipo salvaje como el de fusión. [34]

El cDNA también se ha analizado utilizando pIII mediante un sistema de dos cremalleras de leucina complementarias, [37] Direct Interaction Rescue [38] o mediante la adición de un enlazador de 8-10 aminoácidos entre el cDNA y pIII en el C-terminal. [39]

pVIII [ editar ]

pVIII es la principal proteína de la cubierta de los fagos Ff. Los péptidos generalmente se fusionan al extremo N-terminal de pVIII. [34] Por lo general, los péptidos que pueden fusionarse con pVIII tienen entre 6 y 8 aminoácidos de longitud. [34] La restricción de tamaño parece tener menos que ver con el impedimento estructural causado por la sección agregada [40] y más con la exclusión de tamaño causada por pIV durante la exportación de proteína de cubierta. [40] Dado que hay alrededor de 2700 copias de la proteína en un fago típico, es más probable que la proteína de interés se exprese polivalentemente incluso si se usa un fagémido. [34] Esto hace que el uso de esta proteína sea desfavorable para el descubrimiento de socios de unión de alta afinidad. [34]

Para superar el problema del tamaño de pVIII, se han diseñado proteínas de cubierta artificiales. [41] Un ejemplo es la proteína de cubierta artificial invertida (ACP) de Weiss y Sidhu, que permite la visualización de proteínas grandes en el extremo C-terminal. [41] Los ACP podrían mostrar una proteína de 20 kDa, sin embargo, solo a niveles bajos (en su mayoría solo monovalentemente). [41]

pVI [ editar ]

pVI se ha utilizado ampliamente para la visualización de bibliotecas de ADNc. [34] La presentación de bibliotecas de ADNc a través de la presentación de fagos es una alternativa atractiva al método de levadura-2-híbrido para el descubrimiento de proteínas y péptidos que interactúan debido a su alta capacidad de rendimiento. [34] pVI se ha utilizado preferentemente para pVIII y pIII para la expresión de bibliotecas de ADNc porque se puede añadir la proteína de interés al extremo C-terminal de pVI sin afectar en gran medida el papel de pVI en el ensamblaje de fagos. Esto significa que el codón de parada en el ADNc ya no es un problema. [42] Sin embargo, la presentación de ADNc en fagos siempre está limitada por la incapacidad de la mayoría de los procariotas para producir modificaciones postraduccionales presentes en las células eucariotas o por el plegamiento incorrecto de proteínas de múltiples dominios.

Si bien pVI ha sido útil para el análisis de bibliotecas de ADNc, pIII y pVIII siguen siendo las proteínas de cubierta más utilizadas para la presentación de fagos. [34]

pVII y pIX [ editar ]

En un experimento en 1995, se intentó la visualización de glutatión S-transferasa tanto en pVII como en pIX y fracasó. [43] Sin embargo, la presentación en fagos de esta proteína se completó con éxito después de la adición de una secuencia señal periplásmica (pelB u ompA) en el extremo N-terminal. [44] En un estudio reciente, se ha demostrado que AviTag, FLAG e His pueden mostrarse en pVII sin la necesidad de una secuencia de señal. Luego, la expresión de los Fv de cadena sencilla (scFv) y los receptores de células T de cadena única (scTCR) se expresaron tanto con como sin la secuencia señal. [45]

PelB (una secuencia señal de aminoácidos que dirige la proteína al periplasma donde una peptidasa señal luego escinde PelB) mejoró el nivel de presentación de fagos en comparación con las fusiones pVII y pIX sin la secuencia señal. Sin embargo, esto condujo a la incorporación de más genomas de fagos auxiliares en lugar de genomas de fagémidos. En todos los casos, los niveles de presentación de fagos fueron más bajos que con la fusión pIII. Sin embargo, la visualización inferior podría ser más favorable para la selección de aglutinantes debido a que la visualización inferior está más cerca de la visualización monovalente real. En cinco de seis ocasiones, las fusiones pVII y pIX sin pelB fueron más eficaces que las fusiones pIII en los ensayos de selección por afinidad. El documento incluso continúa afirmando que las plataformas de visualización pVII y pIX pueden superar a pIII a largo plazo. [45]

El uso de pVII y pIX en lugar de pIII también podría ser una ventaja porque el rescate del virión puede realizarse sin romper el enlace virión-antígeno si el pIII usado es de tipo salvaje. En cambio, se podría escindir en una sección entre la perla y el antígeno para eluir. Dado que el pIII está intacto, no importa si el antígeno permanece unido al fago. [45]

Fagos T7 [ editar ]

El problema de usar fagos Ff para la presentación de fagos es que requieren que la proteína de interés se transloque a través de la membrana interna bacteriana antes de ensamblarse en el fago. [46] Algunas proteínas no pueden someterse a este proceso y, por lo tanto, no pueden mostrarse en la superficie de los fagos Ff. En estos casos, se utiliza en su lugar la visualización de fagos T7. [46] En la presentación del fago T7, la proteína que se mostrará se une al extremo C-terminal de la proteína de la cápside del gen 10 de T7. [46]

La desventaja de usar T7 es que el tamaño de la proteína que se puede expresar en la superficie se limita a péptidos más cortos porque los grandes cambios en el genoma de T7 no se pueden acomodar como en M13 donde el fago solo alarga su capa para adaptarse a la genoma más grande dentro de él. Sin embargo, puede ser útil para la producción de una gran biblioteca de proteínas para la selección de scFV donde el scFV se expresa en un fago M13 y los antígenos se expresan en la superficie del fago T7. [47]

Recursos y herramientas de bioinformática [ editar ]

Las bases de datos y las herramientas computacionales para mimotopos han sido una parte importante del estudio de presentación de fagos. [48] Bases de datos, [49] programas y servidores web [50] se han utilizado ampliamente para excluir péptidos no relacionados con el objetivo, [51] caracterizar las interacciones entre moléculas pequeñas y proteínas y mapear las interacciones entre proteínas y proteínas. Los usuarios pueden usar la estructura tridimensional de una proteína y los péptidos seleccionados del experimento de presentación de fagos para mapear epítopos conformacionales. Algunos de los métodos computacionales rápidos y eficientes están disponibles en línea. [50]

Ver también [ editar ]

  • Evolución dirigida
  • interacciones proteína-proteína
  • Secuencia líder PelB

Técnicas competitivas:

  • Sistema de dos híbridos
  • visualización de ARNm
  • Pantalla de ribosoma

Referencias [ editar ]

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Lectura adicional [ editar ]

  • Ledsgaard L, Kilstrup M, Karatt-Vellatt A, McCafferty J, Laustsen AH (2018). "Conceptos básicos de la tecnología de presentación de fagos de anticuerpos" (PDF) . Toxinas . 10 (6): 236. doi : 10,3390 / toxins10060236 . PMC  6024766 . PMID  29890762 .
  • Selección versus diseño en ingeniería química
  • La biblioteca de fagos de anticuerpos humanos ETH-2
  • Sidhu SS, Lowman HB, Cunningham BC, Wells JA (2000). "Presentación de fagos para la selección de péptidos de unión novedosos". Meth. Enzymol . Métodos en enzimología. 328 : 333–63. doi : 10.1016 / S0076-6879 (00) 28406-1 . ISBN 9780121822293. PMID  11075354 .

Enlaces externos [ editar ]

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