El análisis de restricción de ADNr amplificado (ADN ribosómico) es la extensión de la técnica de RFLP ( polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ) al gen que codifica la subunidad ribosómica pequeña (16s) de las bacterias . La técnica implica una amplificación enzimática usando cebadores dirigidos a las regiones conservadas en los extremos del gen 16s, seguido de digestión usando enzimas de restricción tetracutter . Se dice que el patrón obtenido es representativo de las especies analizadas. Los patrones obtenidos a partir de varias enzimas de restricción se pueden utilizar para caracterizar filogenéticamente aislados cultivados y genes 16s obtenidos mediante clonación de ADN comunitario [1]
Vaneechoutte y col. , [2] fueron de los primeros en utilizar este método y lo aplicaron para caracterizar especies de Mycobacterium y especies de Acinetobacter [3]Numerosos otros estudios han aplicado ARDRA para diferentes taxones bacterianos. Basado en la fórmula simple para la frecuencia de ocurrencia aleatoria de un sitio de restricción, una secuencia de 4 pb puede ocurrir una vez cada 256 pb. Una enzima de restricción que tenga un sitio de reconocimiento de más de 4 pb sería irrelevante con respecto a un gen de aproximadamente 1500 pb tal como el que codifica la subunidad ribosómica 16s. Varias enzimas de restricción tetracutter están disponibles en el mercado. En aras de la significación estadística, se deben usar al menos tres enzimas de restricción para el análisis a fin de superar la probabilidad de que ciertas enzimas de restricción produzcan patrones similares para organismos no tan relacionados.
El amplicón a analizar debe corresponder preferiblemente a un tamaño superior a 1000 pb, simplemente para encontrar una mayor posibilidad del sitio de restricción. Los amplicones deben purificarse preferiblemente antes de la digestión. Esto se puede realizar mediante numerosos kits de purificación disponibles comercialmente. Se debe tener cuidado al elegir las enzimas de restricción. Ciertas enzimas de restricción reconocen los mismos sitios y no pueden contribuir productivamente al análisis. Se recomienda la digestión durante la noche (10-16 horas) de aproximadamente 300-500 ng de ADN de amplicón en un sistema de 20 μL con 4-5 unidades de Enzima de Restricción junto con el tampón recomendado a la temperatura prescrita. Después de la digestión, la reacción se detiene y la digestión completa se procesa en un gel de agarosa al 2-3% a 90-100 V.El gel debe tener una longitud que permita la resolución adecuada de fragmentos menores, tan pequeños como 100-200 bp.
El análisis de los patrones se realiza con métodos utilizados para patrones RAPD . Los grupos de bacterias relacionadas se pueden representar en forma de cladograma o filograma . Después del análisis inicial, un programa de análisis multivariado como NT-SYS [4] o PAST [5] proporciona detalles sobre la presencia o ausencia de bandas, marcadas como 1 (para presencia) y 0 (para ausencia). Los datos se pueden utilizar posteriormente para generar un filograma o cladograma.. La tabla de datos se puede utilizar para trazar un árbol filogenético que indicaría la relación de los organismos basándose en el patrón de restricción obtenido de sus respectivos genes 16s. También se dispone de software comercial para el análisis de estos patrones, los más utilizados son los paquetes GelCompar II y BioNumerics .