Ensayo de proteínas de Bradford
El ensayo de proteínas de Bradford fue desarrollado por Marion M. Bradford en 1976. [1] Es un procedimiento analítico espectroscópico rápido y preciso [2] que se utiliza para medir la concentración de proteína en una solución. La reacción depende de la composición de aminoácidos de las proteínas medidas.
El ensayo de Bradford, un colorimétrico proteína de ensayo , se basa en una absorbancia de desplazamiento del colorante azul brillante de Coomassie G-250 . El tinte azul brillante de Coomassie G-250 existe en tres formas: aniónica (azul), neutra (verde) y catiónica (rojo). [3] En condiciones ácidas, la forma roja del tinte se convierte en su forma azul, uniéndose a la proteína que se está analizando. Si no hay proteína que unir, la solución permanecerá marrón. El tinte forma un complejo no covalente fuerte con el grupo carboxilo de la proteína por la fuerza de van der Waals y el grupo amino a través de interacciones electrostáticas. [1]Durante la formación de este complejo, la forma roja del colorante de Coomassie primero dona su electrón libre a los grupos ionizables de la proteína, lo que provoca una alteración del estado nativo de la proteína y, en consecuencia, expone sus bolsas hidrófobas . Estos bolsillos en la estructura terciaria de la proteína se unen de forma no covalente a la región no polar del tinte a través de la primera interacción de enlace ( fuerzas de van der Waals ) que colocan los grupos amina positivos en las proximidades de la carga negativa del tinte. El vínculo se refuerza aún más por la segunda interacción de vínculo entre los dos, la interacción iónica. Cuando el tinte se une a la proteína, provoca un cambio de 465 nm a 595 nm, razón por la cual las lecturas de absorbancia se toman a 595 nm. [4]
La forma catiónica (no unida) es verde / roja y tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se ha mantenido a 465 nm . La forma aniónica unida del tinte, que se mantiene unida por interacciones hidrófobas e iónicas, tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se ha mantenido a 595 nm . [5] El aumento de absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de tinte unido y, por lo tanto, a la cantidad (concentración) de proteína presente en la muestra. [ cita requerida ]
A diferencia de otros ensayos de proteínas, el ensayo de proteínas de Bradford es menos susceptible a la interferencia de varios compuestos químicos como el sodio, el potasio o incluso los carbohidratos como la sacarosa, que pueden estar presentes en las muestras de proteínas. [2] Una excepción son las concentraciones elevadas de detergente . El dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente común, se puede encontrar en extractos de proteínas porque se usa para lisar células al interrumpir la bicapa lipídica de la membrana y para desnaturalizar proteínas para SDS-PAGE . Mientras que otros detergentes interfieren con el ensayo a alta concentración, la interferencia causada por SDS es de dos modos diferentes, y cada uno ocurre a una concentración diferente. Cuando las concentraciones de SDS están por debajo de la concentración micelar crítica(conocido como CMC, 0,00333% p / V a 0,0667%) en una solución de colorante Coomassie, el detergente tiende a unirse fuertemente a la proteína, inhibiendo los sitios de unión de proteínas para el reactivo colorante. Esto puede provocar subestimaciones de la concentración de proteínas en solución. Cuando las concentraciones de SDS están por encima de CMC, el detergente se asocia fuertemente con la forma verde del tinte Coomassie, provocando que el equilibrio cambie, produciendo así más de la forma azul. Esto provoca un aumento de la absorbancia a 595 nm independientemente de la presencia de proteínas. [ cita requerida ]
Otras interferencias pueden provenir del tampón utilizado al preparar la muestra de proteína. Una alta concentración de tampón provocará una concentración de proteína sobreestimada debido al agotamiento de los protones libres de la solución por la base conjugada del tampón. Esto no será un problema si se usa una concentración baja de proteína (posteriormente el tampón). [ cita requerida ]
