El ensayo de proteínas de Bradford fue desarrollado por Marion M. Bradford en 1976. [1] Es un procedimiento analítico espectroscópico rápido y preciso [2] que se utiliza para medir la concentración de proteína en una solución. La reacción depende de la composición de aminoácidos de las proteínas medidas.
Principio
El ensayo de Bradford, un colorimétrico proteína de ensayo , se basa en una absorbancia de desplazamiento del colorante Azul Brillante de Coomassie G-250 . El tinte Coomassie Brilliant Blue G-250 existe en tres formas: aniónica (azul), neutra (verde) y catiónica (rojo). [3] En condiciones ácidas, la forma roja del tinte se convierte en su forma azul, uniéndose a la proteína que se está analizando. Si no hay proteína que unir, la solución permanecerá marrón. El tinte forma un complejo no covalente fuerte con el grupo carboxilo de la proteína por la fuerza de van der Waals y el grupo amino a través de interacciones electrostáticas. [1] Durante la formación de este complejo, la forma roja del colorante Coomassie primero dona su electrón libre a los grupos ionizables de la proteína, lo que provoca una alteración del estado nativo de la proteína, lo que expone sus bolsas hidrofóbicas . Estos bolsillos en la estructura terciaria de la proteína se unen de forma no covalente a la región no polar del tinte a través de la primera interacción de enlace ( fuerzas de van der Waals ) que colocan los grupos amina positivos en las proximidades de la carga negativa del tinte. El vínculo se refuerza aún más por la segunda interacción de vínculo entre los dos, la interacción iónica. Cuando el tinte se une a la proteína, provoca un cambio de 465 nm a 595 nm, razón por la cual las lecturas de absorbancia se toman a 595 nm. [4]
La forma catiónica (no unida) es verde / roja y tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se ha mantenido a 465 nm . La forma aniónica unida del tinte, que se mantiene unida por interacciones hidrófobas e iónicas, tiene un espectro de absorción máximo que históricamente se ha mantenido a 595 nm . [5] El aumento de absorbancia a 595 nm es proporcional a la cantidad de tinte unido y, por lo tanto, a la cantidad (concentración) de proteína presente en la muestra. [ cita requerida ]
A diferencia de otros ensayos de proteínas, el ensayo de proteínas de Bradford es menos susceptible a la interferencia de varios compuestos químicos como el sodio, el potasio o incluso los carbohidratos como la sacarosa, que pueden estar presentes en las muestras de proteínas. [2] Una excepción son las concentraciones elevadas de detergente . El dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente común, se puede encontrar en extractos de proteínas porque se usa para lisar células al interrumpir la bicapa lipídica de la membrana y para desnaturalizar proteínas para SDS-PAGE . Mientras que otros detergentes interfieren con el ensayo a alta concentración, la interferencia causada por SDS es de dos modos diferentes, y cada uno ocurre a una concentración diferente. Cuando las concentraciones de SDS están por debajo de la concentración micelar crítica (conocida como CMC, 0,00333% P / V a 0,0667%) en una solución de colorante Coomassie, el detergente tiende a unirse fuertemente a la proteína, inhibiendo los sitios de unión a proteínas para el reactivo colorante. Esto puede provocar subestimaciones de la concentración de proteínas en solución. Cuando las concentraciones de SDS están por encima de CMC, el detergente se asocia fuertemente con la forma verde del tinte Coomassie, provocando que el equilibrio cambie, produciendo así más de la forma azul. Esto provoca un aumento de la absorbancia a 595 nm independientemente de la presencia de proteínas. [ cita requerida ]
Otras interferencias pueden provenir del tampón utilizado al preparar la muestra de proteína. Una alta concentración de tampón provocará una sobreestimación de la concentración de proteína debido al agotamiento de los protones libres de la solución por la base conjugada del tampón. Esto no será un problema si se utiliza una concentración baja de proteína (posteriormente, el tampón). [ cita requerida ]
Para medir la absorbancia de un compuesto incoloro se debe realizar un ensayo de Bradford. Algunos compuestos incoloros, como las proteínas, se pueden cuantificar a una densidad óptica de 280 nm debido a la presencia de anillos aromáticos como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina, pero si ninguno de estos aminoácidos está presente, la absorción no se puede medir a 280 nm. [6]
Ventajas
Muchas soluciones que contienen proteínas tienen la mayor absorción a 280 nm en el espectrofotómetro, el rango UV. Esto requiere espectrofotómetros capaces de medir en el rango UV, lo que muchos no pueden. Además, la absorción máxima a 280 nm requiere que las proteínas contengan aminoácidos aromáticos como tirosina (Y), fenilalanina (F) y / o triptófano (W). No todas las proteínas contienen estos aminoácidos, un hecho que sesgará las mediciones de concentración. Si los ácidos nucleicos están presentes en la muestra, también absorberían luz a 280 nm, sesgando aún más los resultados. Al utilizar el ensayo de proteínas de Bradford, se pueden evitar todas estas complicaciones simplemente mezclando las muestras de proteínas con el colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 (reactivo de Bradford) y midiendo sus absorbancias a 595 nm, que está en el rango visible. [7]
El procedimiento para el ensayo de proteínas de Bradford es muy fácil y sencillo de seguir. Se realiza en un solo paso en el que se agrega el reactivo de Bradford a un tubo de ensayo junto con la muestra. Después de mezclar bien, la mezcla cambia casi inmediatamente a un color azul. Cuando el tinte se une a las proteínas a través de un proceso que dura aproximadamente 2 minutos, se produce un cambio en el máximo de absorción del tinte de 465 nm a 595 nm en soluciones ácidas. [2] Este tinte crea fuertes enlaces no covalentes con las proteínas, a través de interacciones electrostáticas con los grupos amino y carboxilo, así como interacciones de Van Der Waals. Solo las moléculas que se unen a las proteínas en solución exhiben este cambio en la absorción, lo que elimina la preocupación de que las moléculas no unidas del tinte puedan contribuir a la lectura de absorción obtenida experimentalmente. Este proceso es más beneficioso ya que es menos costoso que otros métodos, es fácil de usar y tiene una alta sensibilidad del tinte a las proteínas. [8]
Después de 5 minutos de incubación, la absorbancia se puede leer a 595 nm usando un espectrofotómetro ; una máquina de fácil acceso.
Este ensayo es uno de los ensayos más rápidos realizados en proteínas. [9] El tiempo total que se tarda en configurar y completar el ensayo es inferior a 30 minutos. [10] Todo el experimento se realiza a temperatura ambiente.
El ensayo de proteínas de Bradford puede medir cantidades de proteínas tan pequeñas como de 1 a 20 μg. [11] Es una técnica extremadamente sensible.
El reactivo colorante es un producto estable listo para usar preparado en ácido fosfórico . Puede permanecer a temperatura ambiente hasta 2 semanas antes de que comience a degradarse.
Las muestras de proteínas suelen contener sales, disolventes, tampones, conservantes, agentes reductores y agentes quelantes de metales. Estas moléculas se utilizan con frecuencia para solubilizar y estabilizar proteínas. Otros ensayos de proteínas como BCA y Lowry son ineficaces porque moléculas como los agentes reductores interfieren con el ensayo. [12] El uso de Bradford puede ser ventajoso contra estas moléculas porque son compatibles entre sí y no interferirán. [13]
El gráfico lineal adquirido del ensayo (absorbancia frente a concentración de proteína en μg / ml) se puede extrapolar fácilmente para determinar la concentración de proteínas utilizando la pendiente de la línea.
Es una técnica sensible. También es muy simple: medir la DO a 595 nm después de 5 minutos de incubación. Este método también puede hacer uso de un espectrofotómetro Vis. [14]
Desventajas
El ensayo de Bradford es lineal en un rango corto, típicamente de 0 µg / mL a 2000 µg / mL, por lo que a menudo es necesario diluir una muestra antes del análisis. Al hacer estas diluciones, el error en una dilución se agrava en diluciones adicionales, lo que da como resultado una relación lineal que puede no siempre ser precisa.
Las condiciones básicas y los detergentes, como el SDS, pueden interferir con la capacidad del tinte para unirse a la proteína a través de sus cadenas laterales. [9] Sin embargo, existen algunos reactivos de Bradford compatibles con detergentes. El ensayo de Bradford depende de la secuencia de la proteína. Por lo tanto, si la proteína no contiene un número ideal de residuos aromáticos, el tinte no podrá unirse a la proteína de manera eficiente. Otra desventaja del ensayo de proteínas de Bradford es que este método depende de comparar la absorbancia de la proteína con la de una proteína estándar. Si la proteína no reacciona al tinte de manera similar a la proteína estándar, es posible que la concentración medida sea inexacta.
Los reactivos de este método tienden a manchar los tubos de ensayo. No se pueden usar los mismos tubos de ensayo ya que la mancha afectaría la lectura de absorbancia. Este método también es sensible al tiempo. Cuando se analiza más de una solución, es importante asegurarse de que cada muestra se incubó durante el mismo período de tiempo para una comparación precisa. [15]
También se inhibe por la presencia de detergentes, aunque este problema puede aliviarse mediante la adición de ciclodextrinas a la mezcla de ensayo. [dieciséis]
Gran parte de la falta de linealidad se debe al equilibrio entre dos formas diferentes del tinte que se altera al agregar la proteína. El ensayo de Bradford linealiza midiendo la proporción de absorbancias, 595 sobre 450 nm. Este ensayo de Bradford modificado es aproximadamente 10 veces más sensible que el convencional. [17]
El colorante Coomassie Blue G250 utilizado para unirse a las proteínas en el método Bradford original se une fácilmente a los grupos de proteínas arginina y lisina. Esto es una desventaja porque la preferencia del tinte para unirse a estos aminoácidos puede resultar en una respuesta variada del ensayo entre diferentes proteínas. Se han realizado cambios en el método original, como aumentar el pH añadiendo NaOH o añadiendo más tinte, para corregir esta variación. Aunque estas modificaciones dan como resultado un ensayo menos sensible, un método modificado se vuelve sensible a los detergentes que pueden interferir con la muestra. [18]
Ejemplo de procedimiento de Bradford
Materiales
- Gammaglobulina de plasma bovino liofilizado
- Coomassie Azul Brillante 1
- NaCl 0,15 M
- Espectrofotómetro y cubetas
- Micropipetas
Procedimiento (ensayo estándar, 20-150 µg de proteína; 200-1500 µg / ml)
- Prepare una serie de estándares diluidos con NaCl 0,15 M hasta concentraciones finales de 0 (blanco = sin proteína), 250, 500, 750 y 1500 µg / mL. También prepare diluciones seriadas de la muestra desconocida que se va a medir.
- Agregue 100 µL de cada uno de los anteriores a un tubo de ensayo separado (o tubo de espectrofotómetro si usa un Spectronic 20 ).
- Agregue 5.0 mL de Coomassie Blue a cada tubo y mezcle mediante vórtice o inversión.
- Ajuste el espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm, utilizando el tubo que no contiene proteína (blanco).
- Espere 5 minutos y lea cada uno de los estándares y cada una de las muestras a una longitud de onda de 595 nm.
- Trace la absorbancia de los estándares frente a su concentración. Calcule el coeficiente de extinción y calcule las concentraciones de las muestras desconocidas.
Procedimiento (microensayo, 1-10 µg de proteína / ml)
- Prepare concentraciones estándar de proteína de 1, 5, 7.5 y 10 µg / mL. Prepare un blanco de NaCl solamente. Prepare una serie de diluciones de muestra.
- Agregue 100 µL de cada uno de los anteriores a tubos separados (use tubos de microcentrífuga) y agregue 1.0 mL de Coomassie Blue a cada tubo.
- Encienda y ajuste un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm, y ponga en blanco el espectrofotómetro con cubetas de 1,5 ml.
- Espere 2 minutos y lea la absorbancia de cada estándar y muestra a 595 nm.
- Trace la absorbancia de los estándares frente a su concentración. Calcule el coeficiente de extinción y calcule las concentraciones de las muestras desconocidas.
Usando los datos obtenidos para encontrar la concentración de desconocidos
En resumen, para encontrar una curva estándar, se deben usar concentraciones variables de BSA ( Albúmina de suero bovino ) [2] para crear una curva estándar con la concentración graficada en el eje xy la absorbancia graficada en el eje y. Solo se usa una concentración estrecha de BSA (2-10 ug / mL) para crear una curva estándar precisa. [19] El uso de un amplio rango de concentración de proteínas dificultará la determinación de la concentración de la proteína desconocida. Esta curva estándar se usa luego para determinar la concentración de la proteína desconocida. A continuación se explica cómo se pasa de la curva estándar a la concentración de lo desconocido.
Primero, agregue una línea de mejor ajuste o regresión lineal y muestre la ecuación en el gráfico. Idealmente, el valor de R 2 será lo más cercano posible a 1. R representa la suma de los valores cuadrados del ajuste restado de cada punto de datos. Por lo tanto, si R 2 es mucho menor que uno, considere rehacer el experimento para obtener uno con datos más confiables. [20]
La ecuación que se muestra en el gráfico proporciona un medio para calcular la absorbancia y, por lo tanto, la concentración de las muestras desconocidas. En el gráfico 1, x es concentración ey es absorbancia, por lo que se debe reorganizar la ecuación para resolver x e ingresar la absorbancia de la incógnita medida. [21] Es probable que la desconocida tenga números de absorbancia fuera del rango del estándar. Estos no deben ser cálculos incluidos, ya que la ecuación dada no puede aplicarse a números fuera de sus limitaciones. A gran escala, se debe calcular el coeficiente de extinción utilizando la ley de Beer-Lambert A = εLC en la que A es la absorbancia medida, ε es la pendiente de la curva estándar, L es la longitud de la cubeta y C es la concentración. siendo determinado. [22] En una microescala, no se puede usar una cubeta y, por lo tanto, solo se tiene que reorganizar para resolver x.
Para lograr una concentración que tenga sentido con los datos, se deben normalizar las diluciones, concentraciones y unidades de lo desconocido (Tabla 1). Para hacer esto, se debe dividir la concentración por el volumen de proteína para normalizar la concentración y multiplicar por la cantidad diluida para corregir cualquier dilución hecha en la proteína antes de realizar el ensayo.
Ensayos alternativos
Los ensayos de proteínas alternativos incluyen:
- Espectroscopia ultravioleta visible
- Ensayo de proteína Biuret
- Ensayo de proteínas de Lowry
- Ensayo de proteína BCA
- Ensayo de proteína negra amido
Referencias
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Otras lecturas
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- Zor, T .; Selinger, Z. (1996), "La linealización del ensayo de proteínas de Bradford aumenta su sensibilidad: estudios teóricos y experimentales", Anal. Biochem. , 236 (2): 302–308, doi : 10.1006 / abio.1996.0171 , PMID 8660509
- Noble, JE; Bailey, MJA (2009), "Cuantificación de proteínas", Métodos Enzymol. , Methods in Enzymology, 463 : 73–95, doi : 10.1016 / S0076-6879 (09) 63008-1 , ISBN 9780123745361, PMID 19892168
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- Dennison, Clive (2003), "Guía para el aislamiento de proteínas", Focus on Structural Biology , 3 : 39, ISBN 978-1402012242
- Ibáñez, Jorge G. (2007), Química ambiental: fundamentos , p. 60, ISBN 978-0387260617
enlaces externos
- Química del ensayo de Bradford
- Espectroscopia de longitud de camino variable
- OpenWetWare