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Para la célula hematopoyética humana, consulte Célula madre hematopoyética .

Una unidad formadora de colonias ( UFC, UFC, UFC ) es una unidad utilizada en microbiología para estimar el número de bacterias viables o células fúngicas en una muestra. Viable se define como la capacidad de multiplicarse mediante fisión binaria en condiciones controladas. El conteo con unidades formadoras de colonias requiere cultivar los microbios y contar solo las células viables, en contraste con el examen microscópico que cuenta todas las células, vivas o muertas. La apariencia visual de una colonia en un cultivo celular requiere un crecimiento significativo y, al contar las colonias, no se sabe con certeza si la colonia surgió de una célula o de un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias refleja esta incertidumbre.

Teoría [ editar ]

Una dilución hecha con bacterias y agua peptonada se coloca en una placa de agar ( recuento en placa de agar para muestras de alimentos o agar de soja Trypticase para muestras clínicas) y se extiende sobre la placa inclinándola en el patrón que se muestra.

El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para dar lugar a colonias en condiciones específicas de medio nutriente, temperatura y tiempo. En teoría, una célula viable puede dar lugar a una colonia mediante la replicación. Sin embargo, las células solitarias son la excepción en la naturaleza, y lo más probable es que el progenitor de la colonia fuera una masa de células depositadas juntas. [ cita requerida ] Además, muchas bacterias crecen en cadenas (por ejemplo, Streptococcus ) o grupos (por ejemplo, Staphylococcus). La estimación del número de microbios por UFC, en la mayoría de los casos, subestimará el número de células vivas presentes en una muestra por estas razones. Esto se debe a que el recuento de CFU supone que cada colonia está separada y fundada por una única célula microbiana viable. [1]

El recuento en placa es lineal para E. coli en el rango de 30 a 300 UFC en una placa de Petri de tamaño estándar . [2] Por lo tanto, para asegurar que una muestra produzca UFC en este rango, se requiere la dilución de la muestra y la siembra en placa de varias diluciones. Por lo general, se utilizan diluciones de diez veces y la serie de diluciones se siembra en placas en réplicas de 2 o 3 en el intervalo de diluciones elegido. A menudo se colocan en placa 100 µl, pero también se utilizan cantidades mayores de hasta 1 ml. Los volúmenes de recubrimiento más altos aumentan los tiempos de secado, pero a menudo no dan como resultado una mayor precisión, ya que pueden ser necesarios pasos de dilución adicionales. [3]La UFC / placa se lee de una placa en el rango lineal, y luego las UFC / g (o UFC / mL) del original se deducen matemáticamente, teniendo en cuenta la cantidad plateada y su factor de dilución (p. Ej. CLSI VET01S ).

Una solución de bacterias en una concentración desconocida a menudo se diluye en serie para obtener al menos una placa con un número contable de bacterias. En esta figura, la placa "x10" es adecuada para contar.

Una ventaja de este método es que diferentes especies microbianas pueden dar lugar a colonias que son claramente diferentes entre sí, tanto microscópicamente como macroscópicamente . La morfología de la colonia puede ser de gran utilidad en la identificación del microorganismo presente. [ cita requerida ]

Una comprensión previa de la anatomía microscópica del organismo puede brindar una mejor comprensión de cómo la UFC / ml observada se relaciona con el número de células viables por mililitro. Alternativamente, es posible disminuir el número promedio de células por UFC en algunos casos agitando la muestra antes de realizar la dilución. Sin embargo, muchos microorganismos son delicados y sufrirían una disminución en la proporción de células que son viables cuando se colocan en un vórtice. [ cita requerida ]

Notación de registro [ editar ]

Las concentraciones de unidades formadoras de colonias se pueden expresar usando notación logarítmica, donde el valor mostrado es el logaritmo en base 10 de la concentración. [4] [5] [6] Esto permite que la reducción logarítmica de un proceso de descontaminación se calcule como una simple resta.

Usos [ editar ]

Las unidades formadoras de colonias se utilizan para cuantificar los resultados en muchos métodos de recuento y recuento microbiológico, que incluyen:

  • El método de vertido en placa en el que la muestra se suspende en una placa de Petri utilizando agar fundido enfriado a aproximadamente 40-45 ° C (justo por encima del punto de solidificación para minimizar la muerte celular inducida por el calor). Una vez solidificado el agar nutritivo, se incuba la placa. [7]
  • El método de placa de extensión en el que la muestra (en un volumen pequeño) se extiende por la superficie de una placa de agar nutritivo y se deja secar antes de la incubación para el recuento. [7]
  • El método de filtro de membrana en el que la muestra se filtra a través de un filtro de membrana, luego el filtro se coloca en la superficie de una placa de agar nutritivo (con las bacterias hacia arriba). Durante la incubación, los nutrientes se filtran a través del filtro para apoyar el crecimiento de las células. Como la superficie de la mayoría de los filtros es menor que la de una placa de Petri estándar, el rango lineal del recuento de placas será menor. [7]
  • Los métodos de Miles y Misra o el método de la placa de goteo en el que una alícuota muy pequeña (generalmente alrededor de 10 microlitros) de muestra de cada dilución en serie se deja caer en una placa de Petri. El plato de gotas debe leerse mientras las colonias son muy pequeñas para evitar la pérdida de UFC a medida que crecen juntas. [ cita requerida ]

Sin embargo, con las técnicas que requieren el uso de una placa de agar, no se puede utilizar ninguna solución fluida porque la pureza de la muestra no puede ser desconocida y no es posible contar las células una a una en el líquido. [8]

Herramientas para contar colonias [ editar ]

La forma tradicional de enumerar las UFC con un "contador de clics" y un bolígrafo. Cuando las colonias son demasiado numerosas, es una práctica común contar las UFC solo en una fracción de la placa.

El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual con un bolígrafo y un contador de clics. Por lo general, esta es una tarea sencilla, pero puede resultar muy laboriosa y requerir mucho tiempo cuando hay que enumerar muchas placas. Alternativamente, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware + software). [ cita requerida ]

Software para contar CFU [ editar ]

Las colonias se pueden enumerar a partir de imágenes de placas utilizando herramientas de software. Los experimentadores generalmente tomarían una foto de cada placa que necesitan contar y luego analizarían todas las imágenes (esto se puede hacer con una simple cámara digital o incluso una cámara web). Dado que se necesitan menos de 10 segundos para tomar una sola fotografía, en lugar de varios minutos para contar CFU manualmente, este enfoque generalmente ahorra mucho tiempo. Además, es más objetivo y permite la extracción de otras variables como el tamaño y el color de las colonias.

  • OpenCFU [1] es un programa gratuito y de código abierto diseñado para optimizar la facilidad de uso, la velocidad y la solidez. Ofrece una amplia gama de filtros y controles, así como una interfaz de usuario moderna. OpenCFU está escrito en C ++ y usa OpenCV para el análisis de imágenes. [9]
  • NICE es un programa escrito en MATLAB que proporciona una forma sencilla de contar colonias a partir de imágenes. [10] [11]
  • ImageJ y CellProfiler : Algunas macros [12] y complementos deImageJy algunas canalizaciones de CellProfiler [13] pueden usarse para contar colonias. Esto a menudo requiere que el usuario cambie el código para lograr un flujo de trabajo eficiente, pero puede resultar útil y flexible. Un problema principal es la ausencia de una GUI específicaque puede hacer que la interacción con los algoritmos de procesamiento sea tediosa.

Además del software basado en computadoras de escritorio tradicionales, hay aplicaciones para dispositivos Android e iOS disponibles para el conteo de colonias semiautomático y automático. La cámara integrada se usa para tomar fotografías de la placa de agar y se usa un algoritmo interno o externo para procesar los datos de la imagen y estimar el número de colonias. [14] [15] [16] [17]

Sistemas automatizados [ editar ]

Muchos de los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano, ya que muchas de las técnicas de investigación realizadas por humanos que cuentan células individuales tienen una alta probabilidad de error. Debido al hecho de que los investigadores cuentan regularmente las células manualmente con la ayuda de una luz transmitida, esta técnica propensa a errores puede tener un efecto significativo en la concentración calculada en el medio líquido principal cuando las células están en números bajos.

Un contador de colonias automatizado que utiliza procesamiento de imágenes.

Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas completamente automatizados. [18] [19] Por lo general, son costosos y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para funcionar juntos para una configuración específica. [ cita requerida ] Alternativamente, algunos sistemas automáticos utilizan el paradigma de enchapado en espiral . [ cita requerida ]

Algunos de los sistemas automatizados, como los sistemas de MATLAB, permiten contar las células sin tener que teñirlas. Esto permite reutilizar las colonias para otros experimentos sin el riesgo de matar los microorganismos con manchas. Sin embargo, una desventaja de estos sistemas automatizados es que es extremadamente difícil diferenciar entre los microorganismos con polvo o rayones en las placas de agar sangre porque tanto el polvo como los rayones pueden crear una combinación muy diversa de formas y apariencias. [20]

Unidades alternativas [ editar ]

En lugar de unidades formadoras de colonias, se pueden utilizar los parámetros Número más probable (MPN) y Unidades Fishman modificadas (MFU) [ cita requerida ] . El método del número más probable cuenta las células viables y es útil cuando se enumeran concentraciones bajas de células o se enumeran microbios en productos en los que las partículas hacen que el conteo en placa no sea práctico. [21] Las Unidades Fishman modificadas tienen en cuenta las bacterias que son viables, pero no cultivables. [ cita requerida ]

Ver también [ editar ]

  • Recuento de células
  • Medio de crecimiento
  • Método Miles y Misra
  • Numero mas probable
  • Galjanoplastia de réplica
  • Placa viral

Referencias [ editar ]

  1. ^ Goldman, Emanuel; Green, Lorrence H (24 de agosto de 2008). Manual práctico de microbiología, segunda edición (Google eBook) (segunda edición). Estados Unidos: CRC Press, Taylor y Francis Group. pag. 864. ISBN 978-0-8493-9365-5. Consultado el 16 de octubre de 2014 .
  2. ^ Raza RS, Dotterrer WD (mayo de 1916). "El número de colonias permitidas en placas de agar satisfactorias" . Revista de bacteriología . 1 (3): 321–31. doi : 10.1128 / JB.1.3.321-331.1916 . PMC 378655 . PMID 16558698 .  
  3. ^ Schug, Angela R .; Bartel, Alexander; Meurer, Marita; Scholtzek, Anissa D .; Brombach, Julian; Hensel, Vivian; Fanning, Séamus; Schwarz, Stefan; Feßler, Andrea T. (1 de diciembre de 2020). "Comparación de dos métodos para la determinación del recuento celular en el curso de las pruebas de susceptibilidad a biocidas" . Microbiología veterinaria . 251 : 108831. doi : 10.1016 / j.vetmic.2020.108831 .
  4. ^ "Log10 unidades formadoras de colonias por gramo" . Enciclopedia Titi Tudorancea . Consultado el 25 de septiembre de 2016 .
  5. ^ Daniel YC Fung (2009). "Recuentos de células viables" . Bioscience International . Consultado el 25 de septiembre de 2016 .
  6. ^ Martin Cole (1 de noviembre de 2005). "Principios de las pruebas microbiológicas: base estadística del muestreo" (PDF) . Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para Alimentos (ICMSF). Archivado desde el original (PDF) el 31 de octubre de 2017 . Consultado el 25 de septiembre de 2016 .
  7. ^ a b c "USP 61: Pruebas de enumeración microbiana" (PDF) . Farmacopea de Estados Unidos . Consultado el 24 de marzo de 2015 . [ enlace muerto permanente ]
  8. ^ Reynolds, Jackie. "Protocolos de dilución en serie" . www.microbelibrary.org . Archivado desde el original el 17 de noviembre de 2015 . Consultado el 15 de noviembre de 2015 .
  9. ^ Geissmann Q (2013). "OpenCFU, un nuevo software gratuito y de código abierto para contar colonias de células y otros objetos circulares" . PLOS ONE . 8 (2): e54072. doi : 10.1371 / journal.pone.0054072 . PMC 3574151 . PMID 23457446 .  
  10. ^ https://www.nist.gov/pml/div686/sources_detectors/nice.cfm [ se necesita una cita completa ]
  11. ^ Clarke ML, Burton RL, Hill AN, Litorja M, Nahm MH, Hwang J (agosto de 2010). "Recuento automatizado de colonias bacterianas de alto rendimiento y bajo costo" . Citometría de la Parte A . 77 (8): 790–7. doi : 10.1002 / cyto.a.20864 . PMC 2909336 . PMID 20140968 .  
  12. ^ Cai Z, Chattopadhyay N, Liu WJ, Chan C, Pignol JP, Reilly RM (noviembre de 2011). "Colonias de recuento digital optimizado de ensayos clonogénicos utilizando el software ImageJ y macros personalizadas: comparación con el recuento manual". Revista internacional de biología de las radiaciones . 87 (11): 1135–46. doi : 10.3109 / 09553002.2011.622033 . PMID 21913819 . S2CID 25417288 .  
  13. ^ Vokes MS, Carpenter AE (abril de 2008). Uso de CellProfiler para la identificación y medición automática de objetos biológicos en imágenes . Protocolos actuales en biología molecular . Capítulo 14. págs. Unidad 14.17. doi : 10.1002 / 0471142727.mb1417s82 . ISBN 978-0471142720. PMC  4302752 . PMID  18425761 .
  14. ^ "Contador de colonias de Promega" . Tienda de aplicaciones . Consultado el 28 de septiembre de 2018 .
  15. ^ "APD Colony Counter App PRO - Aplicaciones en Google Play" . play.google.com . Consultado el 28 de septiembre de 2018 .
  16. ^ Austerjost, Jonas; Marquard, Daniel; Raddatz, Lukas; Geier, Dominik; Becker, Thomas; Scheper, Thomas; Lindner, Patrick; Beutel, Sascha (agosto de 2017). "Una aplicación de dispositivo inteligente para la determinación automatizada de colonias de E. coli en placas de agar" . Ingeniería en Ciencias de la Vida . 17 (8): 959–966. doi : 10.1002 / elsc.201700056 . ISSN 1618-0240 . PMC 6999497 . PMID 32624845 .   
  17. ^ "Alcance CFU" . Tienda de aplicaciones . Consultado el 28 de septiembre de 2018 .
  18. ^ "Contadores de colonias: contador de colonias robótico - manipulador de placas" . www.neutecgroup.com . Consultado el 28 de septiembre de 2018 .
  19. ^ "Contador de colonias completamente automático de AAA Lab Equipment Video | LabTube" . www.labtube.tv . Consultado el 28 de septiembre de 2018 .
  20. ^ Brugger, Silvio D .; Baumberger, Christian; Jost, Marcel; Jenni, Werner; Brugger, Urs; Mühlemann, Kathrin (20 de marzo de 2012). "Recuento automatizado de unidades formadoras de colonias bacterianas en placas de agar" . PLOS ONE . 7 (3): e33695. doi : 10.1371 / journal.pone.0033695 . ISSN 1932-6203 . PMC 3308999 . PMID 22448267 .   
  21. ^ "Manual analítico bacteriano: número más probable de diluciones en serie" . Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos . Octubre de 2010.

Lectura adicional [ editar ]

  • Fishman, William H .; Bernfeld, Peter (1955). [31] Glucuronidasas . Métodos en enzimología . 1 . págs.  262 –9. doi : 10.1016 / 0076-6879 (55) 01035-5 . ISBN 978-0-12-181801-2.