Purificación de ácido nucleico basada en columna giratoria
La purificación de ácidos nucleicos basada en columna giratoria es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente los ácidos nucleicos . Este método se basa en el hecho de que el ácido nucleico se unirá a la fase sólida de sílice bajo ciertas condiciones.
Las etapas del método son lisar, unir, lavar y eluir. [1] [2] Más específicamente, esto implica la lisis de las células objetivo para liberar ácidos nucleicos , la unión selectiva del ácido nucleico a una membrana de sílice, el lavado de partículas e inhibidores que no están unidos a la membrana de sílice y la elución del ácido nucleico . ácido, siendo el resultado final ácido nucleico purificado en solución acuosa.
Para la lisis, las células (sangre, tejido, etc.) de la muestra deben someterse a un tratamiento para romper la membrana celular y liberar el ácido nucleico. Dependiendo del material de destino, esto puede incluir el uso de detergente u otros tampones, proteinasas u otras enzimas, calentamiento a varios tiempos/temperaturas, o disrupción mecánica, como cortar con un cuchillo u homogeneizador , usar un mortero y mano, o perla. batiendo con un molino de bolas.
Para la unión, se añade una solución tampón a la muestra lisada junto con etanol o isopropanol . Luego, la muestra en la solución de unión se transfiere a una columna giratoria y la columna se coloca en una centrífuga o se conecta al vacío. La centrífuga/vacío fuerza la solución a través de una membrana de sílice que se encuentra dentro de la columna de centrifugación, donde, en las condiciones iónicas adecuadas, los ácidos nucleicos se unirán a la membrana de sílice, a medida que pasa el resto de la solución. Con el material de destino unido, se puede eliminar el flujo continuo.
Para lavar, se agrega un nuevo tampón a la columna, luego se centrifuga/aspira a través de la membrana. Este tampón está destinado a mantener las condiciones de unión, mientras elimina las sales de unión y otros contaminantes restantes. Generalmente se necesitan varios lavados, a menudo con porcentajes crecientes de etanol/isopropanol, hasta que el ácido nucleico de la membrana de sílice esté libre de contaminantes. El último 'lavado' es a menudo un paso seco para permitir que el alcohol se evapore, dejando solo ácidos nucleicos purificados unidos a la columna.
Finalmente, la elución es el proceso de agregar una solución acuosa a la columna, lo que permite que el ácido nucleico hidrófilo abandone la columna y vuelva a la solución. Este paso se puede mejorar con sal, pH, tiempo o calor. Finalmente, para capturar el eluato/eluyente, la columna se transfiere a un microtubo limpio antes de un último paso de centrifugado.
