La separación de ADN por adsorción de sílice es un método de separación de ADN que se basa en moléculas de ADN que se unen a superficies de sílice en presencia de ciertas sales y bajo ciertas condiciones de pH, generalmente realizado en un microchip recubierto de canales de sílice. [1] [2]
Significado
Los métodos convencionales para la extracción de ADN , como la precipitación con etanol o las preparaciones que utilizan kits de purificación comerciales, no se pueden integrar en microchips porque requieren múltiples pasos de procesamiento prácticos. Además, también requieren grandes equipos y grandes volúmenes de reactivos y muestras. Las resinas de sílice evitan estos problemas mediante la integración en microchips, donde la extracción en fase sólida proporciona un análisis preciso del ADN a pequeña escala. [3]
Operaciones
Para llevar a cabo la separación del ADN por adsorción de sílice, se coloca una muestra (que puede ser cualquier cosa, desde células purificadas hasta una muestra de tejido) en un chip especializado y se lisa . La mezcla resultante de proteínas , ADN , fosfolípidos , etc., pasa luego a través del canal donde el ADN es adsorbido por una superficie de sílice en presencia de soluciones con alta fuerza iónica. Las mayores eficiencias de adsorción de ADN se producen en presencia de una solución tampón con un pH igual o inferior al pKa de los grupos silanol de la superficie.
El mecanismo detrás de la adsorción de ADN sobre sílice no se comprende completamente; una posible explicación implica la reducción de la carga negativa de la superficie de sílice debido a la alta fuerza iónica del tampón. Esta disminución de la carga superficial conduce a una disminución de la repulsión electrostática entre el ADN cargado negativamente y la sílice cargada negativamente. Mientras tanto, el tampón también reduce la actividad del agua al formatear los iones hidratados. Esto conduce a que la superficie de la sílice y el ADN se deshidraten. Estas condiciones conducen a una situación energéticamente favorable para que el ADN se adsorba en la superficie de la sílice. [ cita requerida ]
Una explicación más detallada de cómo el ADN se une a la sílice se basa en la acción del guanidinio HCl (GuHCl), que actúa como un caótropo. Un caótropo desnaturaliza las biomoléculas al interrumpir la capa de hidratación que las rodea. Esto permite que los iones cargados positivamente formen un puente de sal entre la sílice cargada negativamente y la columna vertebral del ADN cargada negativamente en alta concentración de sal. A continuación, el ADN puede lavarse con alto contenido de sal y etanol y, finalmente, eluirse con bajo contenido de sal.
Una vez que el ADN se adsorbe a la superficie de la sílice, todas las demás moléculas pasan a través de la columna. Lo más probable es que estas moléculas se envíen a una sección de desechos en el chip, que luego se puede cerrar mediante un canal con compuerta o una cámara controlada por presión o voltaje. Luego, el ADN se lava para eliminar cualquier exceso de partículas de desecho de la muestra y luego se eluye del canal utilizando un tampón de elución para su procesamiento posterior . [ cita requerida ]
Se han propuesto y validado las siguientes soluciones para su uso en este proceso de unión al ADN: tampón de carga basado en GuHCl; Lavado de canales: isopropanol al 80%; Elución de ADN: TE a pH 8,4. [ cita requerida ]
Superficies de extracción de micro ADN de silicio
Se han creado métodos que utilizan perlas de sílice y resinas de sílice que pueden aislar moléculas de ADN para la posterior amplificación por PCR. Sin embargo, estos métodos tienen problemas asociados. Primero, las perlas y las resinas son muy variables dependiendo de qué tan bien estén empaquetadas y, por lo tanto, son difíciles de reproducir. Cada carga de un microcanal puede dar como resultado una cantidad diferente de empaquetamiento y, por lo tanto, cambiar la cantidad de ADN que se adsorbe al canal. Además, estos métodos dan como resultado un proceso de fabricación de dos pasos.
Las estructuras de sílice son un método mucho más eficaz de empaquetar material porque se graban en el canal durante su fabricación y, por lo tanto, es el resultado de un proceso de fabricación en un solo paso mediante litografía blanda . Por lo tanto, las estructuras de sílice son más fáciles de usar en diseños altamente paralelizados que las perlas o resinas.
Ver también
Referencias
- ^ Liu, Lingling; Guo, Zilong; Huang, Zhenzhen; Zhuang, Jiaqi; Yang, Wensheng (25 de febrero de 2016). "Separación selectiva por tamaño de fragmentos de ADN mediante el uso de partículas de sílice funcionalizadas con lisina" . Informes científicos . 6 : 22029. Código Bibliográfico : 2016NatSR ... 622029L . doi : 10.1038 / srep22029 . PMC 4766563 . PMID 26911527 .
- ^ Karp, Angela; Isaac, Peter G .; Ingram, David S. (1998). "Aislamiento de ácidos nucleicos usando membranas a base de gel de sílice: métodos basados en el uso de columnas de giro QIAamp". Herramientas moleculares para el cribado de la biodiversidad : 59–63. doi : 10.1007 / 978-94-009-0019-6_14 . ISBN 978-94-010-6496-5.
- ^ Tian, H; Hühmer, AF; Landers, JP (agosto de 2000). "Evaluación de resinas de sílice para la extracción directa y eficiente de ADN de matrices biológicas complejas en formato miniaturizado". Bioquímica analítica . 283 (2): 175-191. doi : 10.1006 / abio.2000.4577 . PMID 10906238 . S2CID 35971689 .
- Cady y col. Purificación de ácidos nucleicos mediante estructuras de silicio microfabricadas. Biosensors and Bioelectronics, 19, 59-66 (2003).
- KA Melzak, CS Sherwood, RFB Turner, CA Haynes. Fuerzas impulsoras para la adsorción de ADN a sílice en soluciones de perclorato. Journal of Colloid and Interface Science, 181, 635–644 (1996).
- Wolfe y col. Hacia un método de extracción en fase sólida basado en microchip para el aislamiento de ácidos nucleicos. Electrophoresis, 23, 727-733 (2002).