Un extintor de oscuridad (también conocido como ventosa de oscuridad ) es una sustancia que absorbe la energía de excitación de un fluoróforo y disipa la energía en forma de calor ; mientras que un extintor típico (fluorescente) reemite gran parte de esta energía en forma de luz . [1] Los extintores de oscuridad se utilizan en biología molecular junto con los fluoróforos. Cuando los dos están muy juntos, como en una molécula o proteína, se suprime la emisión del fluoróforo. Este efecto se puede utilizar para estudiar la geometría molecular y el movimiento.
Un ejemplo de su uso es en TaqMan o ensayo invasor, métodos de genotipado de SNP . Por ejemplo, se utiliza un bucle de horquilla con un fluoróforo y un extintor en la base del tallo. Un cebador de PCR específico de SNP no etiquetado (uno de muchos) con una cola 5 'específica se une a la secuencia que se va a probar, y la polimerasa taq extiende la secuencia que tendrá un extremo 5' específico dependiente del SNP (insensible a polimorfismos aguas arriba de el SNP en cuestión). En la siguiente ejecución se extiende una cartilla , complementaria a esa cola, con un lazo de horquilla. En la siguiente ejecución, el alargamiento de la hebra complementaria linealizará la horquilla que separa el fluoróforo y el extintor.. Una alternativa al uso de extintores es usar FRET donde la combinación de dos tintes da una señal. [2]
Modo de funcionamiento
Los extintores oscuros son tintes sin fluorescencia nativa . Hasta los últimos años, los extintores han sido típicamente un segundo tinte fluorescente, por ejemplo, fluoresceína como indicador y tetrametil-rodamina como extintor (sondas FAM / TAM). Sin embargo, la fluorescencia del extintor puede aumentar el ruido de fondo debido a la superposición entre los espectros de fluorescencia del extintor y del informador. Esta limitación a menudo requiere el uso de filtros ópticos y análisis de datos complejos. Los extintores oscuros ofrecen una solución a este problema porque no ocupan un ancho de banda de emisión. Además, los extintores oscuros permiten la multiplexación (cuando dos o más sondas informador-extintor se utilizan juntas).
Los tintes fluorescentes absorben la luz, lo que coloca al tinte en un estado excitado; el tinte vuelve al estado fundamental desde el estado excitado mediante la emisión de luz (fluorescencia). En un sistema reporter-extintor, el tinte transfiere energía de forma no radiactiva (sin luz) al extintor. Esto devuelve el tinte al estado fundamental y genera el estado excitado del extintor. El extintor luego regresa al estado fundamental a través de la desintegración emisiva ( fluorescencia ) o no radiativa (extinción oscura). En la descomposición oscura o no radiativa, la energía se emite a través de vibraciones moleculares (calor). Con la concentración típica de μM o menos de sonda, el calor de la desintegración sin radiación es demasiado pequeño para afectar la temperatura de la solución.
Ejemplos de extintores oscuros
- Dabsyl (ácido dimetilaminoazobencenosulfónico) se absorbe en el espectro verde y se usa a menudo con fluoresceína. (Dabsyl tiene una absorción casi idéntica, pero tiene un cloruro de sulfonilo para formar conjugados más estables, en lugar de un éster succinimidílico).
- Los extintores de agujeros negros son capaces de apagar todo el espectro visible.
- Los extintores Qxl abarcan todo el espectro visible.
- Iowa black FQ absorbe en la parte verde-amarilla del espectro.
- Bloques RQ negros de Iowa en la parte rojo anaranjado del espectro.
- IRDye QC-1 apaga los tintes del rango visible al infrarrojo cercano (500-900 nm). [3]
Referencias
- ^ Osterman, H., El siguiente paso en la fluorescencia del infrarrojo cercano: IRDye QC-1 Dark Quencher, 2009; Artículo de revisión. Descargar PDF Archivado el 13 de julio de 2011 en la Wayback Machine.
- ^ Peng, X., Chen, H., Draney, DR, Volcheck, WM, un tinte extintor no fluorescente de amplio rango para ensayos FRET, Bioquímica analítica, 2009; (Vol. 388), págs. 220–228. Descargar PDF Archivado el 13 de julio de 2011 en la Wayback Machine.
- ^ Peng, X., Draney, DR, Volcheck, WM, sustrato peptídico fluorescente del infrarrojo cercano desactivado para el ensayo de proteasa del VIH-1, Proc. SPIE, 2006; (6097), [1] [ enlace muerto permanente ]
Otras lecturas
- J. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy , 2a ed., Plenum, Nueva York, 1999 .
- Johansson, MK; Cook, RM (2003). "Dímeros intramoleculares: una nueva estrategia de diseño para sondas apagadas por fluorescencia". Chem. EUR. J . 9 (15): 3466–3471. doi : 10.1002 / quím.200304941 . PMID 12898673 .